폭스바이러스 감염 세포의 번역 조절을 연구하기 위한 Luciferase Reporter 분석

초록

출처: Dhungel, P., et al. 폭스바이러스 감염 세포의 번역 조절을 연구하기 위한 체외 전사 RNA 기반 루시페라제 리포터 분석. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오는 폭스 바이러스에 감염된 세포의 번역 조절을 연구하기 위한 분석을 보여줍니다. 감염되지 않은 세포와 바이러스에 감염된 세포를 반딧불이 루시퍼라제(Fluc) 및 레닐라 루시퍼라제(Rluc)를 암호화하는 mRNA와 함께 형질주입했으며, Fluc mRNA는 5' 폴리(A) 리더 염기서열을 포함했습니다. 용해된 세포에 생물 발광 기질을 추가할 때 두 루시퍼라제의 신호를 측정하여 리더 염기서열에 의해 부여되는 바이러스 감염 세포에서 Fluc mRNA의 번역 이점을 식별합니다.

프로토콜

1. mRNA를 세포에 transfection

1. HeLa 세포를 24웰 플레이트(다음날 약 ~80-90% 합류)에 파종하고 37°C의 인큐베이터에서 5% CO₂로 밤새 배양합니다.
2. HeLa 세포를 감염 다중성(MOI) 5로 백시니아 바이러스(VACV)에 감염시키거나 비교를 위해 감염되지 않은 HeLa 세포를 유지합니다.
   메모: MOI는 세포당 감염성 바이러스 입자의 수입니다.
3. X의 MOI = {[(세포 수 * X) / 바이러스 역가] * 1mL 배지당 바이러스 1000μl.
4. 원하는 h 감염 후(hpi) 후(이 실험에서는 10-12 hpi) 후 그림 1C와 같이 양이온성 지질 형질주입 시약을 사용하여 mRNA(24웰 플레이트의 웰당 총 mRNA 500ng)를 형질주입합니다.
   1. 24웰 플레이트 1웰의 경우, 반딧불이 루시퍼라제(12A-Fluc) mRNA가 함유된 12A 염기서열 480ng과 레닐라 루시퍼라제(Kozak-Rluc) mRNA가 함유된 Kozak 염기서열 20ng을 하나의 마이크로 원심분리 튜브에 혼합합니다. 다른 마이크로 원심분리 튜브에 1.1μL의 양이온성 지질 형질주입 시약을 추가합니다.
   2. 두 튜브에 55μL의 환원된 혈청 배지를 추가합니다. 섞어서 실온에서 5분 동안 배양합니다.
   3. 배양 5분 후, mRNA mRNA 함유 튜브에 환원된 혈청 배지를 함유한 55μL 양이온 지질 형질주입 시약을 추가합니다.
   4. 부드럽지만 철저하게 섞고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
   5. 배양 중에 세포 배양 배지를 제거하고 24웰 플레이트의 웰당 400μL의 환원된 혈청 배지를 추가합니다.
   6. 배양 후 혼합물 100μL를 24웰 플레이트의 한 웰에 적가하고 균일하게 첨가합니다.

2. Luciferase 활동 측정

1. 12A-Fluc 및 Kozak-Rluc mRNA의 동시 transfection 5시간 후 2개의 리포터 어세이를 수행할 수 있는 루시페라제 분석 시스템(예: Dual-Luciferase 리포터 어세이 키트)을 사용하여 루시페라제 활성을 측정합니다.
2. 환원된 혈청 배지를 제거하고 Lucifererase 분석 키트의 구성 요소인 150μL 1x 용해 완충액을 추가하여 세포를 용해합니다.
3. 실온에서 10분 동안 배양한 후 세포를 스크랩하여 용해물을 수집하고 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
4. 용해물을 12,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화합니다.
5. 바닥이 단단한 불투명한 벽의 96웰 흰색 분석 플레이트에 30μL의 상층액을 추가합니다.
6. luciferase 분석 키트와 멀티모드 플레이트 리더 광도계를 사용하여 이중 발광을 측정합니다.
7. 표 1.
   에 설명된 설정을 사용하여 kinetics 기능(웰 단위로)을 사용하여 측정을 수행합니다. 메모: 판독값은 수동 광도계를 사용하여 수행할 수도 있습니다. 큐벳에 Fluc에 대해 동일한 부피의 용해물과 기질을 추가합니다. 2초 동안 기다렸다가 광도계를 사용하여 10초 동안 측정합니다. Fluc 측정 후 광도계에서 큐벳을 빠르게 꺼내고 Rluc용 기판을 동일한 부피로 수동으로 추가합니다. 다시 2초 동안 기다렸다가 광도계를 사용하여 10초 동안 측정합니다.
8. 발광 판독 데이터를 원하는 파일 형식으로 내보냅니다.
9. Fluc 값을 내부 대조군 Rluc 값으로 나누어 감염되지 않은 HeLa 세포와 VACV에 감염된 HeLa 세포에서 12A-Fluc mRNA의 상대적 번역 속도를 결정합니다.
   참고: 그림 2는 상대적인 Fluc 활성을 얻기 위한 원시 데이터의 단계별 분석을 보여줍니다.

표 1: Luciferase 측정 설정 – 권장 부피 또는 시간으로 Luciferase 측정 단계.

들 들

단계	볼륨/시간
루시페라제 분석 기질(Fluc) 주입:	30 μL
대기 / 배양 시간:	2
발광 측정(Fluc):	10 초
정지 & Glo 기판 (RLUC):	30 μL
대기 / 배양 시간:	2
발광 측정(Rluc):	10 초

결과

그림 1: mRNA 합성 및 transfection. (A) 시험관 내 전사의 개략도. 관심 있는 5'-UTR의 다운스트림에서 루시페라제 유전자를 포함하는 PCR에 의해 증폭된 DNA와 T7 promoter를 주형으로 사용합니다. T7 RNA 중합효소는 프로모터에 동원되어 흰색으로 표시된 리보뉴클레오티드를 5'에서 3' 방향으로 추가합니다. mRNA의 길이가 25-30 nt가 되면 역캡 방지 아날로그인 ARCA를 사용하여 m7G 캡을 추가합니다. (B) 시험관 내 전사로부터의 RNA 띠는 1.5% 아가로스 TBE 겔 전기영동을 사용하여 검출하였다. (C) 리포터 mRNA의 세포 내로의 형질주입을 보...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Corning 96 Well Half-Area 흰색 평면 바닥 폴리스티렌 마이크로플레이트	코 닝	3693	단단한 바닥을 가진 불투명한 벽으로 된 96 웰 화이트 플레이트
Dual-Luciferase Reporter 분석 시스템	프로메가	1960회	이중 루시페라제 분석 키트(DLAK)
GloMax Navigator 마이크로플레이트 광도계	프로메가	GM2010	다중 모드 플레이트 리더 광도계라고 합니다
리포펙타민 2000	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	11668019	양이온성 지질 형질주입 시약
옵티-MEM	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	31985070	저감된 혈청 배지

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