방법 논문

항생제의 최소 억제 농도를 평가하기 위한 마이크로타이터 플레이트 방법

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

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출처: Ketelboeter, L. M., et al. 세균성 피오멜라닌 생성을 억제하고 산화 스트레스에 대한 민감도의 증가를 결정하는 방법. J. Vis. 특급 (2015).

이 동영상은 박테리아에 대한 테스트 항생제의 최소 억제 농도(MIC)를 결정하기 위한 마이크로타이터 플레이트 기반 방법을 보여줍니다. 시험용 항생제의 연속 희석액이 들어 있는 마이크로타이터 플레이트에 세균성 병원균 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 현탁액과 박테리아에 의한 피오멜라닌 생성 억제제를 첨가한 후, 웰의 광학 밀도를 측정하여 항생제의 최소 억제 농도와 피오멜라닌 생산 억제제의 영향이 박테리아의 항생제 감수성에 미치는 영향을 계산합니다.

프로토콜

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1. 96웰 플레이트의 항생제 최소 억제 농도(MIC) 분석

  1. NTBC(2-[2-니트로-4-(트리플루오로메틸)벤조일]-1,3-시클로헥산디온)을 사용하거나 사용하지 않고 LB(Luria-Bertani)에서 테스트할 균주의 야간 배양을 설정합니다.
    메모: 이 프로토콜은 300μM NTBC의 대표 수준을 사용하여 설명됩니다.
    1. 300μM NTBC를 2ml LB에 추가합니다. NTBC가 없는 조건의 경우 2ml LB에 등가 부피의 비히클(디메틸 설폭사이드, DMSO)을 추가합니다.
    2. 멸균 이쑤시개를 사용하여 하나의 분리된 박테리아 군체를 튜브에 접종합니다. 각 균주에 대해 NTBC가 있는 하나의 문화와 NTBC가 없는 하나의 문화가 있습니다. 공기 배양기에서 조직 배양 회전기를 사용하여 37°C에서 폭기로 밤새 배양합니다.
  2. 다음 날, MIC 분석 설정을 위한 LB + NTBC 및 LB + DMSO 마스터 솔루션을 만듭니다. 600μM의 농도에서 NTBC를 첨가하면 접종물을 추가할 때 2배로 희석되어 최종 농도가 300μM가 됩니다.
    1. 한 가지 균주에 대해 하나의 항생제를 테스트하려면 2ml LB에 600μM NTBC를 첨가하고 혼합하여 NTBC 마스터 용액을 만듭니다. 2ml LB에 등가 부피의 차량(DMSO)을 추가하고 혼합하여 NTBC 마스터 솔루션이 없는 용액을 만듭니다. 이러한 솔루션을 사용하여 항생제 스톡 용액을 만들고 96웰 플레이트에 희석 시리즈를 설정할 수 있습니다.
      메모: 마스터 용액 제형은 파이펫팅 오류를 설명할 수 있는 추가 용액을 산출합니다. 마스터 솔루션은 테스트된 항생제 및 균주의 수에 따라 필요에 따라 확장하거나 축소할 수 있습니다.
  3. LB + NTBC 또는 LB + DMSO 마스터 솔루션에서 항생제 용액을 준비합니다.
    메모: 이러한 용액의 항생제 농도는 최종 원하는 농도의 두 배여야 합니다. 100 μl를 96 웰 플레이트에서 4 개의 웰로 옮길 수있는 충분한 용액을 만들어야합니다.
    1. 64μg/ml에서 겐타마이신 +/- NTBC 원액을 준비합니다. 이 용액을 만들려면 0.288μl의 겐타마이신 스톡(100mg/ml)을 450μl LB + NTBC 또는 LB + DMSO 마스터 용액에 추가합니다.
      참고: 녹농균 PAO1에 대한 겐타마이신의 최대 농도는 32μg/ml입니다.
    2. kanamycin +/- NTBC 원액을 256μg/ml로 만듭니다. 이 해결책을 만들기 위하여는, kanamycin 주식 (30 mg/ml)의 3.84 μl를 450 μl LB + NTBC 또는 LB + DMSO 주된 solutions.
      에 추가하십시오 메모: 녹농균 PAO1에 대한 카나마이신의 최대 농도는 128μg/ml입니다.
    3. 8μg/ml에서 토브라마이신 +/- NTBC 원액을 준비합니다. 이 솔루션을 만들려면 0.36μl의 토브라마이신 스톡(10mg/ml)을 450μl LB + NTBC 또는 LB + DMSO 마스터 솔루션에 추가합니다.
      메모: 녹농균 PAO1의 경우 토브라마이신의 최대 농도는 4μg/ml입니다.
      메모: 항생제와 농도는 검사할 박테리아에 맞게 조정할 수 있습니다.
  4. 각 2x 항생제 용액 100μl를 96웰 플레이트의 4웰에 추가합니다. 이러한 솔루션을 행 A에 배치합니다. 예를 들어, 겐타마이신은 A1에서 A4까지, 카나마이신은 A5에서 A8까지, 토브라마이신은 A9에서 A12까지에 배치되어야 합니다. 96웰 플레이트 설정 다이어그램은 그림 1A를 참조하십시오.
    메모: 하나의 플레이트에서 여러 항생제를 테스트할 수 있지만 다른 균주로 인한 교차 오염 가능성을 없애기 위해 플레이트당 하나의 균주만 테스트해야 합니다.
  5. 50μl의 LB + NTBC 또는 LB + DMSO 마스터 용액을 96웰 플레이트의 B-H 행에 추가합니다. 한 플레이트는 LB + NTBC이고 다른 플레이트는 LB + DMSO인지 확인합니다. 그림 1A를 참조하십시오.
    1. LB + NTBC의 항생제는 LB + NTBC를 사용하십시오. LB + DMSO의 항생제는 LB + DMSO를 사용합니다.
  6. 마이크로 피펫터를 사용하여 50μl의 용액을 A행에서 B행으로 이동시켜 항생제의 2배 연속 희석을 수행합니다. 용액을 혼합하고, 피펫 팁을 변경하고, B행에서 C행으로 용액 50μl를 이동합니다. 나머지 행에 대해 반복합니다. G 행을 희석 한 후 해당 행에서 용액 50 μl를 제거하고 버립니다. H행을 박테리아 성장에 대한 무항생제 대조군으로 사용합니다. 그림 1B.
    참조 참고: A부터 G까지의 각 웰에는 이제 LB + NTBC 또는 LB + DMSO에 최종 원하는 농도의 2배로 50μl의 항생제가 포함되어 있습니다. H 행에는 항생제가 없는 LB + NTBC 또는 LB + DMSO가 포함되어 있습니다.
  7. 하룻밤 배양의 OD600을 측정합니다. 배지에 존재하는 피오멜라닌을 제거하기 위해 OD600 판독값을 취하기 전에 모든 배양을 세척하십시오.
    1. 마이크로 원심분리기에서 1ml의 배양액을 16,000 x g으로 2분 동안 원심분리하여 배양액을 세척합니다. 마이크로 피펫터로 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 1ml LB에 재현탁합니다.
  8. 하룻밤 배양을 LB.
    중 2.75x105 CFU/ml로 희석합니다. 메모: 1 OD600 단위가 녹농균의 경우 1x109 CFU/ml와 동일하다고 가정합니다. OD에서 CFU/ml로의 변환은 다른 박테리아에서 다를 수 있습니다.
  9. 희석된 박테리아 배양액 50μl를 적절한 well.
    에 추가합니다. 메모: NTBC에서 성장한 배양물은 NTBC를 포함하는 웰에 첨가해야 하며, DMSO에서 성장한 배양물은 DMSO를 포함하는 웰에 첨가해야 합니다. 그림 1B를 참조하십시오.
    1. 각 균주 및 항생제 농도에 대해 3개의 웰에 박테리아를 추가합니다. 네 번째 웰에 50μl의 LB를 추가하여 박테리아 오염에 대한 제어 역할을 합니다. 그림 1B를 참조하십시오.
    2. 다중 채널 마이크로 피펫터를 사용하여 웰에 접종합니다. 이웃 우물의 오염을 방지하기 위해 접종물을 추가할 때 피펫 끝이 우물 바닥 근처에 있는지 확인하십시오.
      메모: 웰에 박테리아 배양을 추가하면 항생제와 NTBC 농도가 두 배로 희석됩니다.
  10. 96웰 플레이트를 파라필름으로 덮고 37°C에서 약 24시간 동안 배양합니다.96웰 플레이트를 공기 인큐베이터에서 정적으로 배양합니다.
  11. 우물에서 박테리아가 자라는 플레이트를 검사합니다. MIC는 각 균주의 3가지 복제물 모두에 대해 박테리아 성장이 보이지 않는 가장 낮은 농도의 항생제입니다.
    1. 플레이트의 성장을 육안으로 검사하거나 OD600으로 설정된 플레이트 리더를 사용하여 판독합니다.

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결과

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그림 1: 항생제 MIC 분석 96웰 플레이트 설정 개략도. (A) 시작 농도가 가장 높은 2x 항생제 100μl가 A열에 있습니다. B열부터 H열까지는 항생제가 없는 LB + NTBC 또는 LB + DMSO 50μl로 채워져 있습니다. (B) A열부터 G열까지 2배 연속 희석을 수행하여 각 웰에서 최종 원하는 농도의 2배로 50μl의 희석된 항생제를 생성합니다. H열은 항생제를 사용하지 않는 박테리아 성장을 위한 대조군입니다. 50μl의 LB 또는 접종물을 적절한 웰에 첨가하여 항생제를 최종 농도까지 2배 희석합니다. LB는 항생제의 박테리아 오염을 제어하는 역할을 합니다. GM, 겐타마이신; Km, 카나마이신; Tob, 토브라...

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공개 사항

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선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
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2-[2-니트로-4-(트리플루오로메틸)벤조일]-1,3-시클로헥산디온(NTBC)시그마-알드리치SML0269-50mg니티시논이라고도 합니다. DMSO에 용해됩니다.
H2O2시그마-알드리치216763-100ML30 wt. H2O의 %. 안정화.
겐타마이신골드 바이오G-400-100H에 용해 2 O. 필터는 살균합니다.
카나마이신피셔 사이언티픽BP906-5H에 용해 2 O. 필터는 살균합니다.
토브라마이신시그마-알드리치T4014-100MGH에 용해 2 O. 필터는 살균합니다.

재인쇄 및 허가

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PyomelaninNTBC

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