세포외 기질 강성이 박테리아 감염에 미치는 영향을 연구하기 위한 분석

초록

출처: Bastounis, E. E., et al. 부착 세포의 박테리아 감염에 대한 세포외 기질 강성의 영향을 연구하기 위한 다중 웰 형식 폴리아크릴아미드 기반 분석. J. Vis. 특급. (2018).

이 비디오는 부착 세포의 박테리아 감염에 대한 세포외 기질(ECM) 강성의 영향을 연구하기 위한 분석을 보여줍니다. 콜라겐이 중첩된 다양한 강성의 폴리아크릴아미드 하이드로겔은 생리학적 ECM의 강성을 모방하기 위해 멀티웰 플레이트에 층을 이룹니다. 하이드로겔에 인간 내피 세포를 오버레이하고 세포 내 형광 단백질을 발현하도록 조작된 리스테리아 모노사이토제네스 박테리아로 세포를 감염시킨 후, 유세포 분석을 사용하여 더 단단한 하이드로겔에 존재하는 세포와 더 부드러운 하이드로겔에 존재하는 세포의 내재화된 박테리아를 비교합니다.

프로토콜

1. 멀티웰 플레이트에 얇은 2층 폴리아크릴아미드(PA) 하이드로겔 제조

1. 폴리아크릴아미드 하이드로겔 제작
   메모: 그림 1을 참조하십시오.
   1. 40% 스톡 아크릴아미드 용액 3 - 10%(재료 표 참조)와 0.06 - 0.6%의 2% 스톡 비스-아크릴아미드 용액(재료 표 참조)을 포함하는 수용액을 준비하여 0.6 kPa - 70 kPa 범위의 조정 가능한 강성의 하이드로겔을 제조합니다. 표 1을 참조하십시오.
      1. 0.6kPa 하이드로겔의 경우 3% 아크릴아마이드와 0.045% 비스-아크릴아미드를 혼합합니다. 3kPa 하이드로겔의 경우 5% 아크릴아마이드와 0.074% 비스-아크릴아미드를 혼합합니다. 10kPa 하이드로겔의 경우 10% 아크릴아마이드와 0.075% 비스-아크릴아미드를 혼합합니다. 20kPa 하이드로겔의 경우 8% 아크릴아마이드와 0.195% 비스-아크릴아미드를 혼합합니다. 70kPa 하이드로겔의 경우 10% 아크릴아미드와 0.45% 비스-아크릴아미드를 혼합합니다.
         참....

결과

그림 1: 다양한 강성의 얇은 2층 형광 비드 내장 폴리아크릴아미드(PA) 하이드로겔에 상주하는 숙주 세포의 박테리아 감염 분석. ᅡ.유리 커버슬립은 하이드로겔 부착이 가능하도록 화학적으로 변형됩니다. 3.6 μL의 PA 혼합물이 유리 바닥에 증착됩니다. 혼합물은 중합을 가능하게 하기 위해 12mm 원형 유리 커버슬립으로 덮여 있습니다. 디. 커버 슬립은 바늘 주사기로 제거합니다. 마이크로비드가 포함된 2.4μL의 PA 용액을 하단 레이어 위에 추가하고 원형 유리 커버슬립으로 덮습니다. 에프. 우물에 완충액이 추가되고 커버슬립이 제거됩니다. 사.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약
수산화나트륨 펠릿	어부	시즌 318-500
(3-아미노프로필)트리에톡시실란	시그마	A3648
25% 글루테알데히드	시그마	G6257-100ML
아크릴아마이드 40%	시그마	A4058-100ML
비스-아크릴아미드 용액 (2%w/v)	피셔 사이언티픽	BP1404-250
형광구 카르복실레이트 변형 미세구, 0.1 μm, 황록색 형광(505/515)	인비트로젠	F8803
과황산 암모늄	어부	BP17925
테마드	시그마	T9281-25ML
설포-산파	프로테오켐	C1111-100MG
콜라겐, 쥐의 유형 I 용액	시그마	C3867-1VL
디메틸설폭사이드(DMSO)	J.T. 베이커	9224-01
HEPES, 유리 산	J.T. 베이커	4018-04
Leibovitz의 L-15 매체, 페놀 레드 없음	써모피셔	21083027
MCDB 131 매체, 글루타민 없음	생명 기술	10372019
파운데이션 태아 소 세럼, 로트: A37C48A	제미니 바이오 프로드	900108 500ml
표피 성장 인자, EGF	시그마	E9644
하이드로코르티손	시그마	H0888
L-글루타민 200mM	어부	SH3003401
DPBS 1배	어부	SH30028FS
겐타마이신 설페이트	MP 바이오메디컬	194530
클로람페니콜	시그마	C0378-5G
DifcoTM 한천, 과립	BD (영어)	214530
BBL TM 뇌-심장 주입	BD (영어)	211059
Hoechst 33342, 트리하이드로클로라이드, 트리하이드레이트 - 물 중 10 mg/ul 용액	인비트로젠	H3570
포름 알데히드 16 % EM 등급	전자 현미경 검사	15710-S
Anti-Listeria monocytogenes 항체	아브캠	AB35132
염소 anti-Rabbit IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor® 546 conjugate	써모피셔	A-11035
0.25% 트립신-EDTA, 페놀 레드	써모피셔	25200056
클로스트리듐 조직분해 효소(CLLOSTRIDIUM HISTOLYTIC)에서 추출한 콜라겐분해효소	시그마	C8051
스트렙토마이신 설페이트	피셔 사이언티픽	3810-74-0
자당	칼바이오켐	8510
나트륨 도데 실 설페이트	써모피셔	28364
MES 파우더	시그마	M3885
케이클	J.T. 베이커	3040-05
마그네슘Cl2	J.T. 베이커	2444-1
에그타	아크로스	40991
일회용 실험실 장비
12mm 원형 유리 커버슬립	피셔브랜드	Tel.: 12-545-81	No. 1.5 커버슬립 |10mm 유리 직경 | 코팅
유리 바닥 24웰 플레이트	마텍	P24G-1.5-13-F
35 μm 세포 여과기 캡이 있는 5 ml 폴리스티렌 튜브	송골매	352235
T-25 플라스크	송골매	353118
50ml 원뿔형 튜브	송골매	352070
15ml 원뿔형 튜브	송골매	352196
일회용 혈청 피펫 (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)	송골매	357551
파스퇴르 유리 피펫	폭스바겐	제14672-380
피펫 팁 (1-200 μl, 101-1000 μl)	덴빌	P1122, P1126
파우더 프리 검사 장갑	마이크로플렉스	XC-310
큐벳 박테리아	사르슈테트	67.746
면도칼	폭스바겐	55411-050
주사기 바늘	BD (영어)	305167
0.2um 살균 병	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	전화: 566-0020
주사기 20ml	BD (영어)	제302830
0.2um 필터	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	Tel.: 723-2520
나무 막대기	그레인저	42181501
사란 랩	산타크루즈 바이오테크놀러지	사우스캐롤라이나-3687
플레이트 박테리아	송골매	351029
대형/일회용이 아닌 실험실 장비
조직 배양 후드	빵 굽는 사람	SG504
혈구계	시그마	Z359629
박테리아 인큐베이터	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	IGS180
조직 배양 인큐베이터	누아이레	NU-8700
진공 챔버/탈기 장치	벨라트	42025	37 °C 및 5% CO2
도립 Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope	니콘	니콘-디아폿-200
케이지 인큐베이터	하이슨	관습
Scanford FACScan 분석기	스탠포드와 Cytek, FACScan 업그레이드	관습
피펫 에이드	드러먼드	4-000-110
피펫터(10 μl, 200 μl, 1000ul)	길슨	F144802, F123601, F123602
pH 측정기	메틀러 톨레도	30019028
집게	증권 시세	11000-12
1L 플라스크	피셔브랜드	FB5011000
오토클레이브 기계	암스코	3021
교반 자석 플레이트	벨코	전화: 7760-06000
자석 교반 바	벨코	제1975-00100
분광 광도계	베크만	듀 640
Scanford FACScan 분석기	사이텍 바이오사이언스	커스텀 스탠포드 및 Cytek 업그레이드 FACScan
소프트웨어
현미경 소프트웨어(μManager)	오픈 이미징
매트랩	매트랩 Inc
플로우조	플로우조, LLC
자동 이미지 분석 소프트웨어, CellC	https://sites.google.com/site/cellcsoftware/		소프트웨어는 무료로 사용할 수 있습니다. eexecutable 파일 및 MATLAB 소스 코드는 https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ 에서 얻을 수 있습니다.

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