세포외 기질 강성이 박테리아 감염에 미치는 영향을 연구하기 위한 분석

초록

출처: Bastounis, E. E., et al. 부착 세포의 박테리아 감염에 대한 세포외 기질 강성의 영향을 연구하기 위한 다중 웰 형식 폴리아크릴아미드 기반 분석. J. Vis. 특급. (2018).

이 비디오는 부착 세포의 박테리아 감염에 대한 세포외 기질(ECM) 강성의 영향을 연구하기 위한 분석을 보여줍니다. 콜라겐이 중첩된 다양한 강성의 폴리아크릴아미드 하이드로겔은 생리학적 ECM의 강성을 모방하기 위해 멀티웰 플레이트에 층을 이룹니다. 하이드로겔에 인간 내피 세포를 오버레이하고 세포 내 형광 단백질을 발현하도록 조작된 리스테리아 모노사이토제네스 박테리아로 세포를 감염시킨 후, 유세포 분석을 사용하여 더 단단한 하이드로겔에 존재하는 세포와 더 부드러운 하이드로겔에 존재하는 세포의 내재화된 박테리아를 비교합니다.

프로토콜

1. 멀티웰 플레이트에 얇은 2층 폴리아크릴아미드(PA) 하이드로겔 제조

1. 폴리아크릴아미드 하이드로겔 제작
   메모: 그림 1을 참조하십시오.
   1. 40% 스톡 아크릴아미드 용액 3 - 10%(재료 표 참조)와 0.06 - 0.6%의 2% 스톡 비스-아크릴아미드 용액(재료 표 참조)을 포함하는 수용액을 준비하여 0.6 kPa - 70 kPa 범위의 조정 가능한 강성의 하이드로겔을 제조합니다. 표 1을 참조하십시오.
      1. 0.6kPa 하이드로겔의 경우 3% 아크릴아마이드와 0.045% 비스-아크릴아미드를 혼합합니다. 3kPa 하이드로겔의 경우 5% 아크릴아마이드와 0.074% 비스-아크릴아미드를 혼합합니다. 10kPa 하이드로겔의 경우 10% 아크릴아마이드와 0.075% 비스-아크릴아미드를 혼합합니다. 20kPa 하이드로겔의 경우 8% 아크릴아마이드와 0.195% 비스-아크릴아미드를 혼합합니다. 70kPa 하이드로겔의 경우 10% 아크릴아미드와 0.45% 비스-아크릴아미드를 혼합합니다.
         참고: 바람직한 PA 하이드로겔 강성을 달성하는 방법에 대한 자세한 내용은 다른 곳에서 확인할 수 있습니다.
   2. 각각의 바람직한 하이드로겔 강성에 대해 두 개의 수용액을 준비합니다. 용액 1은 비드가 없는 용액으로, 용액 2는 0.03% 0.1μm 직경의 형광 마이크로 비드를 함유하도록 준비합니다(재료 표 참조).
   3. 용액의 중합을 억제하는 것으로 알려진 산소를 제거하기 위해 15분 동안 진공으로 용액 1 및 2를 탈기합니다.
   4. 용액 1에 10g/mL 스톡 APS 용액 0.6%와 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) 0.43%를 첨가하여 중합을 시작합니다. 신속하게 행동하십시오.
   5. 3.6μL의 용액 1을 24웰 접시의 각 웰 중앙에 추가합니다.
   6. 즉시 웰을 12mm 처리되지 않은 원형 커버슬립으로 덮고 용액 1이 완전히 중합되도록 20분 동안 그대로 둡니다.
   7. 주사기 바늘을 표면에 부드럽게 두드려 덮개 슬립을 쉽게 제거할 수 있도록 끝에 작은 고리를 만듭니다. 주사기 바늘을 사용하여 커버 슬립을 들어 올립니다.
   8. 10g/mL 스톡 APS 용액의 0.6%와 용액 2에 0.43% TEMED를 추가합니다. 2.4 웰 접시의 각 웰에 있는 첫 번째 층 위에 혼합물 24 μL를 증착합니다.
   9. 용액 2를 12mm 원형 유리 커버슬립으로 덮고 두 번째 층의 두께가 최소화되도록 집게를 사용하여 아래쪽으로 부드럽게 누릅니다. 용액 2를 20분 동안 중합시킵니다.
   10. 각 웰에 500μL의 50mM HEPES pH 7.5를 추가한 다음 주사기 바늘과 겸자로 유리 커버슬립을 제거합니다.
2. 폴리아크릴아미드 하이드로겔의 살균, 콜라겐 코팅 및 평형
   1. 조직 배양 후드에서 하이드로겔을 1시간 동안 UV 노출시켜 멸균을 허용합니다.
   2. 0.5% 중량/부피 sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate(Sulfo-SANPAH, 재료 표 참조)의 혼합물을 1% DMSO 및 50mM HEPES pH = 7.5로 준비합니다.
   3. 이 용액 200μL를 하이드로겔의 상부 표면에 추가합니다. 빠르게 행동하여 10분 동안 UV(302nm)에 노출시켜 활성화합니다.
   4. 하이드로겔을 1mL의 50mM HEPES pH = 7.5로 두 번 세척합니다. 필요한 경우 반복하여 과도한 가교제가 제거되었는지 확인합니다.
   5. 50mM의 HEPES에 200μL의 0.25mg/mL 쥐꼬리 콜라겐 I(재료 표 참조)로 하이드로겔을 단백질 코팅합니다. 콜라겐 용액을 위에 올려 하이드로겔을 실온에서 밤새 배양합니다.
      메모: 탈수/증발을 방지하기 위해, 멀티웰 플레이트를 2차 격납고에 배치하고 격납고의 내부 주변에 물에 적신 실험실 세척 조직을 추가한다.
   6. 40X 대물렌즈가 있는 에피형광 또는 컨포칼 현미경을 사용하여 하이드로겔의 두께를 측정합니다. 하이드로겔의 바닥(유리 표면이 있는 곳)과 윗면(형광 비드의 강도가 최대인 곳)의 z 위치를 찾아 이를 수행합니다. 그런 다음 z 위치를 빼서 height.
      를 결정합니다. 메모: 우리는 도립 형광 현미경과 개구수 0.65의 40X 대물렌즈를 사용하여 하이드로겔의 두께를 측정했습니다. 이 시점에서 원자력 현미경 측정(AFM)을 수행하여 하이드로겔의 정확한 강성을 확인할 수도 있습니다(그림 2 참조).
   7. 하이드로겔에 관심 세포를 시딩하기 전에 하이드로겔에 1mL의 배지를 추가하고 37°C에서 30분에서 1시간 동안 배양하여 평형을 보장합니다.
      메모: MCDB-131 전체 배지는 모델 숙주 세포(HMEC-1)가 배양된 배지이기 때문에 추가했습니다(자세한 내용은 2.1단계 참조).

2. 인간 미세혈관 내피 세포 배양 및 하이드로겔 파종(seeding)

1. 10% 소 태아 혈청, 표피 성장 인자 10ng/mL, 하이드로코르티손 1μg/mL 및 L-글루타민 2mM이 보충된 MCDB-131 배지를 포함하는 MCDB-131 전체 배지에서 HMEC-1(인간, 미세혈관 내피) 세포를 배양합니다(재료 표 참조).
2. 3 - 4일마다 confluent culture를 1:6으로 분할하고 40번 통과시까지 세포를 유지합니다.
3. 실험 하루 전에 0.25% 트립신/EDTA를 사용하여 배양 용기에서 세포를 분리합니다. 먼저 세포와 배양 용기를 1x 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척한 다음 적절한 양의 0.25% 트립신/EDTA(100mm 접시 또는 75cm 플라스크당 2mL, 60mm 접시 또는 25cm 플라스크당 1mL)를 첨가하고 플라스크를 37°C에서 5 - 10분 동안 배양하여 세포를 기질에서 분리할 수 있도록 합니다.
4. 원하는 부피의 MCDB-131 전체 배지를 추가하여 트립신을 중화하고 세포 덩어리를 부드럽게 피펫으로 분리한 다음 용액을 원뿔형 원심분리기 튜브에 넣습니다.
5. 세포가 고르게 분포되도록 세포 용액을 부드럽게 소용돌이친 다음 용액 20μL를 꺼내고 유리 혈구계의 커버슬립 아래에 있는 두 개의 챔버를 매우 부드럽게 채웁니다.
6. 원추형 원심분리 튜브에 포함된 세포 용액을 500 x g에서 10분 동안 원심분리를 사용하여 펠렛으로 만듭니다.
7. 10분의 대기 시간 동안 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. 현미경을 사용하여 10X 대물렌즈로 혈구계의 격자선에 초점을 맞춘 다음 핸드 탈리 카운터를 사용하여 1mm x 1mm 정사각형 하나에 있는 세포 수를 계산합니다.
8. 혈구계를 다른 1mm x 1mm 정사각형으로 옮기고 거기에서 세포를 세고 이 과정을 두 번 더 반복합니다. 4개 측정값의 평균을 계산한 다음 평균에 10⁴를 곱합니다. 최종 값은 원심분리되는 세포 현탁액에서 생존 가능한 세포/mL의 수입니다.
9. 원뿔형 원심분리기 튜브에서 액체를 제거하면서 세포 펠릿이 중단되지 않도록 합니다. MCDB-131 전체 배지의 세포를 4 x 10⁵ cells/mL의 농도로 재현탁합니다.
10. 먼저 하이드로겔을 배양하는 데 사용한 배지를 제거한 다음 각 하이드로겔에 1mL의 세포 현탁액을 추가하여 하이드로겔에 현탁액 세포를 시딩합니다.

3. L. monocytogenes에 의한 인간 미세혈관 내피 세포의 감염

1. 감염 3일 전에 글리세롤 스톡(-80°C에서 보관)에서 사용할 Lm 균주를 7.5μg/mL의 클로람페니콜과 200μg/mL의 스트렙토마이신이 포함된 BHI-한천 플레이트에 줄무늬를 그립니다(해당되는 경우).
   메모: 줄무늬를 만들 균주는 야생형 또는 돌연변이일 수 있으며, 형광을 구성적으로 발현하거나(면역염색 JAT1045 사용) ActA 프로모터 하에서 형광을 발현합니다(유세포 분석 또는 견인력 현미경의 경우 JAT983 또는 JAT985가 사용됨).
2. 개별 콜로니가 형성될 때까지 37 °C에서 플레이트를 배양합니다(1 - 2일).
3. 감염 전날, 원하는 균주를 하룻밤 동안 성장시키고 7.5μg/mL의 클로람페니콜(해당되는 경우)과 함께 BHI 배지에서 30°C에서 150rpm으로 흔듭니다.
   1. 15mL 원추형 원심분리 튜브에 5mL의 BHI 배지를 배치하고 7.5μg/mL의 클로람페니콜(해당되는 경우)을 추가한 다음 멸균 10μL 팁을 사용하여 한천 플레이트에서 단일 콜로니를 접종합니다.
4. 다음 날, 감염 직전, 샘플을 1:5로 희석하여 600nm(OD600)에서 박테리아 용액의 광학 밀도를 측정합니다. BHI만 포함된 큐벳을 블랭크 역할로 사용합니다.
5. 하룻밤 배양액을 OD600 0.1로 희석하고 30°C에서 2시간 동안 흔들면서 7.5μg/mL의 클로람페니콜(해당되는 경우)을 BHI 배지에서 배양하여 박테리아가 로그상 성장에 도달할 수 있도록 합니다.
6. 세균 용액의 OD600을 측정하며, 이는 약 0.2 - 0.3으로 예상됩니다. OD600이 더 높으면 BHI만으로 0.2 - 0.3으로 희석합니다.
7. 박테리아 용액 1mL를 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 실온에서 원심분리를 사용하여 2,000 x g에서 4분 동안 스핀다운합니다. 상층액을 제거하고 조직 배양 후드에서 1mL의 조직 배양 등급 PBS에 박테리아 펠릿을 재현탁합니다. 실온에서 4 x g에서 2,000분 동안 회전시켜 박테리아를 두 번 더 씻습니다. 상층액을 제거하고 PBS 1mL에 박테리아를 재현탁합니다.
8. PBS에 재현탁된 박테리아 10 또는 50 μL를 1 mL의 MCDB-131 가득 찬 배지와 혼합하여 감염 혼합물을 준비하여 감염의 다양성을 위해 (MOI; 즉, 숙주 세포당 약 50개의 박테리아 또는 숙주 세포당 10개의 박테리아
)를 포함할 수 있다.
9. 24웰 플레이트의 웰에서 매체를 제거하고 하이드로겔이나 세포를 방해하지 않도록 주의합니다. MCDB-131 전체 배지 1mL로 세포를 1x 세척한 다음 각 웰에 박테리아 1mL를 추가합니다.
10. 접시를 뚜껑으로 덮고 누출을 방지하기 위해 폴리에틸렌 식품 랩으로 접시를 감쌉니다. 플레이트를 원심분리기에 넣고 200 x g에서 10분 동안 샘플을 회전시켜 침입을 동기화합니다. 플레이트를 조직 배양 인큐베이터로 옮기고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
11. MCDB-131 full media로 샘플을 4x 세척하고 조직 배양 incubator로 옮깁니다. 추가로 30분 후에 배지를 20μg/mL의 겐타마이신이 보충된 배지로 교체합니다.

4. 감염에 대한 숙주 세포의 세포외 매트릭스 강성 의존적 민감성을 정량화하기 위한 유세포 분석

1. 콜라겐분해효소 5mg의 무게를 측정하고 15mL 원추형 원심분리 튜브에 넣습니다. 0.25% 트립신-EDTA 10mL를 넣고 잘 섞습니다.
2. 감염 후 8시간 후 24웰 플레이트의 웰에서 배지를 제거하고 조직 배양 PBS로 웰을 1x 세척합니다. 웰에서 PBS를 제거하고 각 웰에 트립신-EDTA/콜라겐분해효소 혼합물 200μL를 추가합니다. 이것을 조직 배양 인큐베이터에 10분 동안 넣어 세포가 완전히 분리될 수 있도록 합니다.
3. 각 웰에 새 피펫을 사용하고 혼합물을 위아래로 8번 피펫으로 만듭니다.세포가 손상되지 않도록 부드럽게 하십시오. 각 웰에 200μL의 전체 배지를 추가하여 트립신을 중화합니다.
4. 각 웰의 400μL 세포 용액을 35μm 세포 스트레이너 캡이 있는 5mL 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다(재료표 참조).
5. 유세포 분석으로 샘플당 10,000 - 20,000개의 세포를 분석합니다. 유세포 분석을 통해 데이터 수집을 수행하고 관련 상용 소프트웨어를 사용하여 웰당 감염된 세포의 비율을 결정합니다. 전방 산점도 대 측면 산점도 플롯을 사용하여 세포 수 분포의 대부분을 게이트화합니다.
   참고 :: 이것은 단일 세포의 분석을 보장하고 파편 또는 세포 이중선 또는 삼중항을 제거합니다.
   1. 대조군에 감염되지 않은 세포의 형광 신호를 측정하고 자가형광을 제외한 감염된 세포의 집단을 게이트합니다.

표 1. 다양한 강성의 폴리아크릴아미드(PA) 하이드로겔의 조성. 이 표에서 주어진 강성(Young's modulus, E)을 달성하기 위한 스톡 40% 아크릴아미드 용액의 비율과 스톡 2% 비스-아크릴아미드 용액의 비율이 서로 다른 열에 표시되어 있습니다.

개 분 분 분 의 분 호

영률(E, kPa)	아크릴아미드 % (재고 40%)	비사크릴아미드 % (재고 2%부터)
0.6	3	0.045
3	5	0.075
10	10	0.075
20	8	0.195
70	10	0.45

결과

그림 1: 다양한 강성의 얇은 2층 형광 비드 내장 폴리아크릴아미드(PA) 하이드로겔에 상주하는 숙주 세포의 박테리아 감염 분석. ᅡ.유리 커버슬립은 하이드로겔 부착이 가능하도록 화학적으로 변형됩니다. 3.6 μL의 PA 혼합물이 유리 바닥에 증착됩니다. 혼합물은 중합을 가능하게 하기 위해 12mm 원형 유리 커버슬립으로 덮여 있습니다. 디. 커버 슬립은 바늘 주사기로 제거합니다. 마이크로비드가 포함된 2.4μL의 PA 용액을 하단 레이어 위에 추가하고 원형 유리 커버슬립으로 덮습니다. 에프. 우물에 완충액이 추가되고 커버슬립이 제거됩니다. 사.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약
수산화나트륨 펠릿	어부	시즌 318-500
(3-아미노프로필)트리에톡시실란	시그마	A3648
25% 글루테알데히드	시그마	G6257-100ML
아크릴아마이드 40%	시그마	A4058-100ML
비스-아크릴아미드 용액 (2%w/v)	피셔 사이언티픽	BP1404-250
형광구 카르복실레이트 변형 미세구, 0.1 μm, 황록색 형광(505/515)	인비트로젠	F8803
과황산 암모늄	어부	BP17925
테마드	시그마	T9281-25ML
설포-산파	프로테오켐	C1111-100MG
콜라겐, 쥐의 유형 I 용액	시그마	C3867-1VL
디메틸설폭사이드(DMSO)	J.T. 베이커	9224-01
HEPES, 유리 산	J.T. 베이커	4018-04
Leibovitz의 L-15 매체, 페놀 레드 없음	써모피셔	21083027
MCDB 131 매체, 글루타민 없음	생명 기술	10372019
파운데이션 태아 소 세럼, 로트: A37C48A	제미니 바이오 프로드	900108 500ml
표피 성장 인자, EGF	시그마	E9644
하이드로코르티손	시그마	H0888
L-글루타민 200mM	어부	SH3003401
DPBS 1배	어부	SH30028FS
겐타마이신 설페이트	MP 바이오메디컬	194530
클로람페니콜	시그마	C0378-5G
DifcoTM 한천, 과립	BD (영어)	214530
BBL TM 뇌-심장 주입	BD (영어)	211059
Hoechst 33342, 트리하이드로클로라이드, 트리하이드레이트 - 물 중 10 mg/ul 용액	인비트로젠	H3570
포름 알데히드 16 % EM 등급	전자 현미경 검사	15710-S
Anti-Listeria monocytogenes 항체	아브캠	AB35132
염소 anti-Rabbit IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor® 546 conjugate	써모피셔	A-11035
0.25% 트립신-EDTA, 페놀 레드	써모피셔	25200056
클로스트리듐 조직분해 효소(CLLOSTRIDIUM HISTOLYTIC)에서 추출한 콜라겐분해효소	시그마	C8051
스트렙토마이신 설페이트	피셔 사이언티픽	3810-74-0
자당	칼바이오켐	8510
나트륨 도데 실 설페이트	써모피셔	28364
MES 파우더	시그마	M3885
케이클	J.T. 베이커	3040-05
마그네슘Cl2	J.T. 베이커	2444-1
에그타	아크로스	40991
일회용 실험실 장비
12mm 원형 유리 커버슬립	피셔브랜드	Tel.: 12-545-81	No. 1.5 커버슬립 |10mm 유리 직경 | 코팅
유리 바닥 24웰 플레이트	마텍	P24G-1.5-13-F
35 μm 세포 여과기 캡이 있는 5 ml 폴리스티렌 튜브	송골매	352235
T-25 플라스크	송골매	353118
50ml 원뿔형 튜브	송골매	352070
15ml 원뿔형 튜브	송골매	352196
일회용 혈청 피펫 (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)	송골매	357551
파스퇴르 유리 피펫	폭스바겐	제14672-380
피펫 팁 (1-200 μl, 101-1000 μl)	덴빌	P1122, P1126
파우더 프리 검사 장갑	마이크로플렉스	XC-310
큐벳 박테리아	사르슈테트	67.746
면도칼	폭스바겐	55411-050
주사기 바늘	BD (영어)	305167
0.2um 살균 병	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	전화: 566-0020
주사기 20ml	BD (영어)	제302830
0.2um 필터	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	Tel.: 723-2520
나무 막대기	그레인저	42181501
사란 랩	산타크루즈 바이오테크놀러지	사우스캐롤라이나-3687
플레이트 박테리아	송골매	351029
대형/일회용이 아닌 실험실 장비
조직 배양 후드	빵 굽는 사람	SG504
혈구계	시그마	Z359629
박테리아 인큐베이터	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	IGS180
조직 배양 인큐베이터	누아이레	NU-8700
진공 챔버/탈기 장치	벨라트	42025	37 °C 및 5% CO2
도립 Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope	니콘	니콘-디아폿-200
케이지 인큐베이터	하이슨	관습
Scanford FACScan 분석기	스탠포드와 Cytek, FACScan 업그레이드	관습
피펫 에이드	드러먼드	4-000-110
피펫터(10 μl, 200 μl, 1000ul)	길슨	F144802, F123601, F123602
pH 측정기	메틀러 톨레도	30019028
집게	증권 시세	11000-12
1L 플라스크	피셔브랜드	FB5011000
오토클레이브 기계	암스코	3021
교반 자석 플레이트	벨코	전화: 7760-06000
자석 교반 바	벨코	제1975-00100
분광 광도계	베크만	듀 640
Scanford FACScan 분석기	사이텍 바이오사이언스	커스텀 스탠포드 및 Cytek 업그레이드 FACScan
소프트웨어
현미경 소프트웨어(μManager)	오픈 이미징
매트랩	매트랩 Inc
플로우조	플로우조, LLC
자동 이미지 분석 소프트웨어, CellC	https://sites.google.com/site/cellcsoftware/		소프트웨어는 무료로 사용할 수 있습니다. eexecutable 파일 및 MATLAB 소스 코드는 https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ 에서 얻을 수 있습니다.

년 년 년 년 년 년 년 년 호 시리즈 년 ) 호 ) ) 년 표시기 년 년 호