$$\rightleftharpoonup{xx}$$
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$$\longrightharp{xx}$$,
1. 멀티웰 플레이트에 얇은 2층 폴리아크릴아미드(PA) 하이드로겔 제조
- 과황산암모늄(APS)을 증류된 초순수에 용해시켜 최종 농도 10g/mL를 얻습니다. 단기 사용(3주)을 위해 용액을 분취하고 4°C에서 보관하십시오.
참고: 위의 용액은 하이드로겔 제조 전에 준비할 수 있습니다.
- 24웰 접시의 유리 활성화
- 실온에서 웰당 500μL의 2M 수산화나트륨(NaOH)을 사용하여 직경 13mm 웰(재료 표 참조)이 있는 24웰 유리 바닥판을 1시간 동안 배양합니다.
- 웰을 초순수로 1x 헹군 다음 95% 에탄올에 500μL의 2%(3-아미노프로필) 트리에톡시실란(재료 표 참조)을 각 웰에 5분 동안 추가합니다.
- 우물을 물로 1회 다시 헹구고 각 우물에 30분 동안 0.5% 글루타르알데히드 500μL를 추가합니다. 우물을 물로 1회 헹구고 뚜껑을 연 상태에서 60°C에서 건조시킵니다.
- 폴리아크릴아미드 하이드로겔 제작
참고: 그림 1을 참조하십시오.
- 40% 스톡 아크릴아미드 용액 3 - 10%(재료 표 참조)와 0.06 - 0.6%의 2% 스톡 비스-아크릴아미드 용액(재료 표 참조)을 포함하는 수용액을 준비하여 0.6 kPa - 70 kPa 범위의 조정 가능한 강성의 하이드로겔을 제조합니다. 표 1을 참조하십시오.
- 0.6kPa 하이드로겔의 경우 3% 아크릴아마이드와 0.045% 비스-아크릴아미드를 혼합합니다. 3kPa 하이드로겔의 경우 5% 아크릴아마이드와 0.074% 비스-아크릴아미드를 혼합합니다. 10kPa 하이드로겔의 경우 10% 아크릴아마이드와 0.075% 비스-아크릴아미드를 혼합합니다. 20kPa 하이드로겔의 경우 8% 아크릴아마이드와 0.195% 비스-아크릴아미드를 혼합합니다. 70kPa 하이드로겔의 경우 10% 아크릴아미드와 0.45% 비스-아크릴아미드를 혼합합니다.
참고: 바람직한 PA 하이드로겔 강성을 달성하는 방법에 대한 자세한 내용은 다른 곳에서 확인할 수 있습니다.
- 각각의 바람직한 하이드로겔 강성에 대해 두 개의 수용액을 준비합니다. 용액 1은 비드가 없는 용액으로, 용액 2는 0.03% 0.1μm 직경의 형광 마이크로 비드를 함유하도록 준비합니다(재료 표 참조).
- 용액의 중합을 억제하는 것으로 알려진 산소를 제거하기 위해 15분 동안 진공으로 용액 1 및 2를 탈기합니다.
- 용액 1에 10g/mL 스톡 APS 용액 0.6%와 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) 0.43%를 첨가하여 중합을 시작합니다. 신속하게 행동하십시오.
- 3.6μL의 용액 1을 24웰 접시의 각 웰 중앙에 추가합니다(준비는 1.2단계 참조).
- 즉시 웰을 12mm 처리되지 않은 원형 커버슬립으로 덮고 용액 1이 완전히 중합되도록 20분 동안 그대로 둡니다.
- 주사기 바늘을 표면에 부드럽게 두드려 덮개 슬립을 쉽게 제거할 수 있도록 끝에 작은 고리를 만듭니다. 주사기 바늘을 사용하여 커버 슬립을 들어 올립니다.
- 10g/mL 스톡 APS 용액의 0.6%와 용액 2에 0.43% TEMED를 추가합니다. 2.4 웰 접시의 각 웰에 있는 첫 번째 층 위에 혼합물 24 μL를 증착합니다.
- 용액 2를 12mm 원형 유리 커버슬립으로 덮고 두 번째 층의 두께가 최소화되도록 집게를 사용하여 아래쪽으로 부드럽게 누릅니다. 용액 2를 20분 동안 중합시킵니다.
- 각 웰에 pH 7.5의 50mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 500μL를 추가한 다음 주사기 바늘과 겸자로 유리 커버슬립을 제거합니다.
- 폴리아크릴아미드 하이드로겔의 살균, 콜라겐 코팅 및 평형
- 조직 배양 후드에서 하이드로겔을 1시간 동안 UV 노출시켜 멸균을 허용합니다.
- 0.5% 중량/부피 sulfosoxynimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate(Sulfo-SANPAH, 재료 표 참조)의 혼합물을 1% 디메틸 설폭사이드(DMSO) 및 50mM HEPES pH = 7.5로 준비합니다.
- 이 용액 200μL를 하이드로겔의 상부 표면에 추가합니다. 빠르게 행동하여 10분 동안 UV(302nm)에 노출시켜 활성화합니다.
- 하이드로겔을 1mL의 50mM HEPES pH = 7.5로 두 번 세척합니다. 필요한 경우 반복하여 과도한 가교제가 제거되었는지 확인합니다.
- 50mM의 HEPES에 200μL의 0.25mg/mL 쥐꼬리 콜라겐 I(재료 표 참조)로 하이드로겔을 단백질 코팅합니다. 콜라겐 용액을 위에 올려 하이드로겔을 실온에서 밤새 배양합니다.
참고: 탈수/증발을 방지하려면 다중 웰 플레이트를 2차 격납고에 놓고 격납고의 내부 주변에 물에 적신 실험실 세척 티슈를 추가하십시오.
- 40X 대물렌즈가 있는 에피형광 또는 컨포칼 현미경을 사용하여 하이드로겔의 두께를 측정합니다. 하이드로겔의 바닥(유리 표면이 있는 곳)과 윗면(형광 비드의 강도가 최대인 곳)의 z 위치를 찾아 이를 수행합니다. 그런 다음 z 위치를 빼서 높이를 결정합니다.
참고: 우리는 하이드로겔의 두께를 측정하기 위해 도립 형광 현미경과 개구수 0.65의 40X 대물렌즈를 사용했습니다. 이 시점에서 하이드로겔의 정확한 강성을 확인하기 위해 원자력 현미경(AFM) 측정을 수행할 수도 있습니다(그림 2 참조).
- 하이드로겔에 관심 세포를 시딩하기 전에 하이드로겔에 1mL의 배지를 추가하고 37°C에서 30분에서 1시간 동안 배양하여 평형을 보장합니다.
참고: MCDB-131 전체 배지는 모델 숙주 세포(HMEC-1)가 배양된 배지이기 때문에 추가했습니다(자세한 내용은 2.1단계 참조).
2. 인간 미세혈관 내피 세포 배양 및 하이드로겔 파종(seeding)
- 10% 소 태아 혈청, 표피 성장 인자 10ng/mL, 하이드로코르티손 1μg/mL 및 L-글루타민 2mM이 보충된 MCDB-131 배지를 포함하는 MCDB-131 전체 배지에서 HMEC-1(인간, 미세혈관 내피) 세포를 배양합니다(재료 표 참조).
- 3-4일마다 confluent culture를 1:6으로 분할하고 40m까지 세포를 유지합니다.
- 실험 하루 전에 0.25% 트립신/EDTA를 사용하여 배양 용기에서 세포를 분리합니다. 먼저 세포와 배양 용기를 1x 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척한 다음 적절한 양의 0.25% 트립신/EDTA(100mm 접시 또는 75cm 플라스크당 2mL, 60mm 접시 또는 25cm 플라스크당 1mL)를 첨가하고 플라스크를 37°C에서 5 - 10분 동안 배양하여 세포를 기질에서 분리할 수 있도록 합니다.
- 원하는 부피의 MCDB-131 전체 배지를 추가하여 트립신을 중화하고 세포 덩어리를 부드럽게 피펫으로 분리한 다음 용액을 원뿔형 원심분리기 튜브에 넣습니다.
- 세포가 고르게 분포되도록 세포 용액을 부드럽게 소용돌이친 다음 용액 20μL를 꺼내고 유리 혈구계의 커버슬립 아래에 있는 두 개의 챔버를 매우 부드럽게 채웁니다.
- 원추형 원심분리 튜브에 포함된 세포 용액을 500 x g에서 10분 동안 원심분리를 사용하여 펠렛으로 만듭니다.
- 10분의 대기 시간 동안 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. 현미경을 사용하여 10X 대물렌즈로 혈구계의 격자선에 초점을 맞춘 다음 핸드 탈리 카운터를 사용하여 1mm x 1mm 정사각형 하나에 있는 세포 수를 계산합니다.
- 혈구계를 다른 1mm x 1mm 정사각형으로 옮기고 거기에서 세포를 세고 이 과정을 두 번 더 반복합니다. 4개 측정값의 평균을 계산한 다음 평균에 104를 곱합니다. 최종 값은 원심분리되는 세포 현탁액에서 생존 가능한 세포/mL의 수입니다.
- 원뿔형 원심분리기 튜브에서 액체를 제거하면서 세포 펠릿이 중단되지 않도록 합니다. MCDB-131 전체 배지의 세포를 4 x 105 cells/mL의 농도로 재현탁합니다.
- 먼저 하이드로겔을 배양하는 데 사용한 배지를 제거한 다음 각 하이드로겔에 1mL의 세포 현탁액을 추가하여 하이드로겔에 현탁액 세포를 시딩합니다.
3. 인간 미세혈관 내피 세포의 리스테리아 모노사이토제네스(Lm) 감염
- 사전 준비
참고: 다음 해결 방법을 미리 준비하십시오.
- 스트렙토마이신(Streptomycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), 겐타마이신(gentamicin) 주식
- 황산 스트렙토마이신 0.5g의 무게를 측정하고 초순수 10mL에 완전히 용해시켜 50mg/mL의 스트렙토마이신 원액을 준비합니다.
- 75mg의 클로람페니콜 무게를 측정하고 100% 에탄올 10mL에 완전히 용해하여 7.5mg/mL의 클로람페니콜 원액을 준비합니다.
- 황산 겐타마이신 0.2g의 무게를 달아 초순수 10mL에 완전히 용해시켜 20mg/mL의 겐타마이신 원액을 준비합니다.
- 0.2μm 주사기 필터로 모든 원액을 필터 멸균하고 장기간 사용(1 - 2개월)을 위해 -20°C에서 보관합니다.
- 뇌 심장 주입(BHI) 배지 및 한천 플레이트
- 두 개의 1-L 플라스크를 찾아 각 플라스크 내부에 마그네틱 교반 막대를 추가합니다.
- BHI 매체의 경우 하나의 플라스크에 BHI 분말 37g을 넣고 최대 1L의 초순수를 추가합니다. 분말이 용해될 때까지 플라스크를 자기 교반 플레이트에 올려 용액을 세게 혼합합니다.
- BHI 한천 플레이트의 경우 두 번째 플라스크에 BHI 분말 37g과 과립 한천 15g(재료 표 참조)을 넣고 최대 1L의 초순수를 추가합니다. 분말이 용해될 때까지 플라스크를 자기 교반 플레이트에 올려 용액을 세게 혼합합니다.
- 플라스크의 뚜껑을 너무 세게 조이지 말고 액체 설정을 사용하거나 오토클레이브의 사양에 따라 용액을 오토클레이브합니다.
- 오토클레이브에서 용액을 제거한 다음 한천-BHI 용액을 55°C로 냉각합니다. 1L 플라스크의 BHI 매체를 멸균 상태로 유지하면 최대 한 달 동안 사용할 수 있습니다.
- 박테리아 한천-BHI 플레이트를 준비하려면 먼저 BHI와 한천이 들어 있는 플라스크에 적절한 경우 항생제를 추가합니다(성장할 박테리아 균주에 따라 다름). 빠른 혼합을 위해 플라스크를 마그네틱 교반 플레이트에 간단히 올려 놓습니다.
참고: 여기에 사용된 항생제는 사용된 Lm 균주에 따라 다르지만 필요한 모든 항생제를 BHI-한천 플레이트에 사용할 수 있습니다. 10403S Lm 균주는 스트렙토마이신에 내성이 있기 때문에 200μg/mL 농도에 스트렙토마이신을, 7.5μg/mL 농도에 클로람페니콜을 첨가했습니다. 이러한 균주는 chloramphenicol acetyltransferase open reading frame을 포함하는 플라스미드와 결합되어 chloramphenicol에 대한 내성을 갖습니다.
- 혼합물을 10cm 폴리스티렌 박테리아 배양 플레이트(플레이트당 약 20mL)에 붓습니다. 거품을 제거하려면 플레이트의 윗면을 짧게 화염을 발라주세요. 접시를 실온에서 밤새 식히십시오.
- 다음날 건조판을 밀봉하고 4°C에서 보관하십시오.
- L. monocytogenes에 의한 인간 미세혈관 내피 세포의 감염
- 감염 3일 전에 글리세롤 스톡(-80°C에서 보관)에서 사용할 Lm 균주를 7.5μg/mL의 클로람페니콜과 200μg/mL의 스트렙토마이신이 포함된 BHI-한천 플레이트에 줄무늬를 그립니다(해당되는 경우).
참고: 줄무늬를 제거할 균주는 야생형 또는 돌연변이일 수 있으며, 형광을 구성적으로 발현하거나(면역염색 JAT1045 사용) ActA 프로모터에서 형광을 발현합니다(유세포 분석 또는 견인력 현미경의 경우 JAT983 또는 JAT985가 사용됨).
- 개별 콜로니가 형성될 때까지 37 °C에서 플레이트를 배양합니다(1 - 2일).
- 감염 전날, 원하는 균주를 하룻밤 동안 성장시키고 7.5μg/mL의 클로람페니콜(해당되는 경우)과 함께 BHI 배지에서 30°C에서 150rpm으로 흔듭니다.
- 15mL 원추형 원심분리 튜브에 5mL의 BHI 배지를 배치하고 7.5μg/mL의 클로람페니콜(해당되는 경우)을 추가한 다음 멸균 10μL 팁을 사용하여 한천 플레이트에서 단일 콜로니를 접종합니다.
- 다음 날, 감염 직전, 샘플을 1:5로 희석하여 600nm(OD600)에서 박테리아 용액의 광학 밀도를 측정합니다. BHI만 포함된 큐벳을 블랭크 역할로 사용합니다.
- 하룻밤 배양액을 OD600 0.1로 희석하고 30°C에서 2시간 동안 흔들면서 7.5μg/mL의 클로람페니콜(해당되는 경우)을 BHI 배지에서 배양하여 박테리아가 로그상 성장에 도달할 수 있도록 합니다.
- 박테리아 용액의 OD600을 측정하며, 이는 약 0.2-0.3으로 예상됩니다. OD600이 더 높으면 BHI만으로 0.2 - 0.3으로 희석합니다.
- 박테리아 용액 1mL를 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 실온에서 원심분리를 사용하여 2,000 x g에서 4분 동안 스핀다운합니다. 상층액을 제거하고 조직 배양 후드에서 1mL의 조직 배양 등급 PBS에 박테리아 펠릿을 재현탁합니다. 실온에서 4 x g에서 2,000분 동안 회전시켜 박테리아를 두 번 더 씻습니다. 상층액을 제거하고 PBS 1mL에 박테리아를 재현탁합니다.
- PBS에 재현탁된 박테리아 10 또는 50 μL를 1 mL의 MCDB-131 가득 찬 배지와 혼합하여 감염 혼합물을 준비하여 감염의 다양성을 위해 (MOI; 즉, 숙주 세포당 약 50개의 박테리아 또는 숙주 세포당 10개의 박테리아
)를 포함할 수 있다.
- 24웰 플레이트의 웰에서 매체를 제거하고 하이드로겔이나 세포를 방해하지 않도록 주의합니다. MCDB-131 전체 배지 1mL로 세포를 1x 세척한 다음 각 웰에 박테리아 1mL를 추가합니다.
- MOI 측정을 위해 일부 감염 혼합물(최소 100μL)을 유지합니다(3.3단계 참조).
- 접시를 뚜껑으로 덮고 누출을 방지하기 위해 폴리에틸렌 식품 랩으로 접시를 감쌉니다. 플레이트를 원심분리기에 넣고 200 x g에서 10분 동안 샘플을 회전시켜 침입을 동기화합니다. 플레이트를 조직 배양 인큐베이터로 옮기고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
- MCDB-131 full media로 샘플을 4x 세척하고 조직 배양 incubator로 옮깁니다. 추가로 30분 후에 배지를 20μg/mL의 겐타마이신이 보충된 배지로 교체합니다.
- 감염의 다양성(MOI) 측정
- 숙주 세포를 박테리아와 함께 초기 30분 동안 배양하는 동안 감염 혼합물을 10배 연속 희석하여 MOI를 측정합니다. 감염 혼합물 100μL와 1x PBS 900μL(10-1 희석)를 혼합하여 10배 희석합니다. 그런 다음 100 μL의 10-1 희석액과 900 μL의 PBS(10-2 희석액)를 혼합합니다.
- 10-5 희석이 얻어질 때까지 계속합니다.
참고: 모든 용액은 희석하기 전에 잘 혼합해야 하며 각 단계에서 깨끗하고 깨끗한 피펫 팁을 사용해야 합니다.
- 희석이 완료되면 10-2 - 10-5 희석액 중 100 μL를 BHI/한천/클로람페니콜/스트렙토마이신 플레이트(해당되는 경우)의 중앙에 놓습니다.
- 불을 사용하여 피펫을 구부려 후크를 만들어 유리 피펫으로 스프레더를 만듭니다. 살균을 위해 피펫을 100% 에탄올에 담근 다음 화염으로 에탄올을 태웁니다.
- 스프레더가 냉각되면 10-5 희석에서 시작하여 더 농축된 혼합물로 이동하여 플레이트에 박테리아 희석액을 균일하게 펴 바릅니다. 플레이트를 37°C에서 2일 동안 거꾸로 배양합니다.
- 콜로니 밀도에 따라 10-3 및 10-4 또는 10-4 및 10-5 희석 플레이트의 콜로니 수를 결정합니다. MOI를 계산하는 방법은 다음과 같습니다.
콜로니 수 × 희석 계수 ÷ 부피 초기 추가 = μL당 콜로니 형성 단위(CFU) 수
μL당 CFU 수 × 웰당 박테리아 혼합물 부피 = 웰당 CFU 수
웰당 CFU 수 × 웰당 세포 부피 = 세포당 박테리아 수
참고: CFU는 식민지 형성 단위를 의미합니다.
- 두 플레이트의 MOI를 평균화하여 최종 MOI를 구합니다.
4. 세포 외 매트릭스 강성을 평가하기 위한 정량적 타임랩스 현미경
검사
24웰 플레이트에서 PA 하이드로겔을 준비하고(1단계 참조), HMEC-1 세포를 시드하고(2단계 참조), 위에서 설명한 대로 JAT983 배양을 하룻밤 동안 성장시킵니다(3단계 참조).
- 감염 당일, MCDB-131 전체 배지 mL당 10μL의 박테리아 펠릿을 혼합하여 감염 혼합물을 준비합니다. 24웰 플레이트의 웰에서 배지를 조심스럽게 제거하고 MCDB-131 전체 배지 1.9mL와 박테리아 혼합물 0.1mL를 각 웰에 추가합니다.
참고: 이 분석에 사용된 낮은 MOI는 숙주 세포에 침입하는 단일 박테리아에서 시작되는 전파 이벤트를 분석하는 데 필요합니다.
- 접시를 뚜껑으로 덮고 누출을 방지하기 위해 플라스틱 랩으로 밀봉하십시오. 플레이트를 원심분리기에 넣고 200 x g에서 10분 동안 샘플을 회전시켜 침입을 동기화합니다.
- 플레이트를 조직 배양 인큐베이터로 옮기고 5분 동안 배양합니다.
- 배지로 샘플을 4번 세척하고 조직 배양 인큐베이터로 옮깁니다. 추가로 5 - 7분 후에 배지를 20μg/mL의 겐타마이신이 보충된 배지로 교체합니다.
- 인큐베이터에서 플레이트를 추가로 5시간 동안 배양하여 actA 프로모터가 켜지고 mTagRFP 개방형 판독 프레임의 발현을 구동할 수 있도록 합니다.
- Leibovitz의 L-15에 10% 소 태아 혈청, 10ng/mL의 표피 성장 인자 및 1μg/mL 하이드로코르티손을 보충하여 생체 현미경 배지를 준비합니다.
참고: L-15에는 이미 2mM L-글루타민이 포함되어 있으므로 MCDB-131 매체의 경우와 같이 추가로 추가할 필요가 없습니다.
- 1 μL의 1 mg/mL Hoechst 염료를 1 mL의 L-15 full media와 혼합하고 각 웰에 첨가하여 세포핵을 염색합니다. 세포를 조직 배양 인큐베이터에 10분 동안 넣은 다음 각 웰에 L-15 전체 배지를 20μg/mL의 겐타마이신이 보충된 1mL의 L-15 전체 배지로 교체합니다. 플레이트를 뚜껑으로 덮고 37°C로 평형을 이룬 현미경의 환경 챔버(재료 표 참조)에 넣습니다.
참고: 이미징을 위해 CCD 카메라(재료 표 참조) 및 0.75 NA의 20X 공기 계획 형석 공기 대물렌즈와 함께 도립 에피 형광 현미경을 사용했습니다. 전력은 50%로 설정하고 노출 시간은 50ms로 설정했습니다. mCherry에 사용되는 현미경 필터는 여기 및 방출을 위해 각각 470/525nm입니다.
- 자동 초점 기능을 사용하여 5분마다 여러 위치를 이미지화하여 다양한 강성 하이드로겔에 파종된 HMEC-1 단층을 통해 Lm이 어떻게 퍼지는지 모니터링합니다.
참고: L-15는 HEPES로 완충되므로 이미징 중에 CO2를 사용할 필요가 없습니다.
표 1. 다양한 강성의 폴리아크릴아미드(PA) 하이드로겔의 조성. 이 표에서 주어진 강성(Young's modulus, E)을 달성하기 위한 스톡 40% 아크릴아미드 용액의 비율과 스톡 2% 비스-아크릴아미드 용액의 비율이 서로 다른 열에 표시되어 있습니다.
개
분
분
분
의
분
호
| 영률(E, kPa) | 아크릴아미드 % (재고 40%) | 비사크릴아미드 % (재고 2%부터) |
| 0.6 | 3 | 0.045 |
| 3 | 5 | 0.075 |
| 10 | 10 | 0.075 |
| 20 | 8 | 0.195 |
| 70 | 10 | 0.45 |
