Determining Antiviral Efficacy of Experimental Drugs through a Plaque Assay(플라크 분석을 통한 실험 약물의 항바이러스 효능 측정)

초록

출처: Yadavalli, T., et al. 돼지 각막 조직 이식은 단순 포진 바이러스 -1 항 바이러스제의 효능을 연구합니다. J. Vis. 특급 (2021년)

이 동영상은 감염된 돼지 각막에서 얻은 바이러스를 사용하여 플라크 분석을 수행하는 방법을 보여줍니다. 돼지 각막은 실험 약물의 항바이러스 효능을 테스트하는 데 사용됩니다.

프로토콜

1. 바이러스 감염 정량화

참고: 약물 치료의 효과를 분석하기 위해 돼지 각막의 바이러스 역가를 매일 평가해야 합니다.

1. 바이러스를 정량화하기 위해 이 실험에서 수행된 것처럼 6-well 플레이트를 사용하는 경우 well당 5 x 10⁵개의 세포 밀도로 Vero 세포를 시딩합니다. 감염되기 하루 전에 이 작업을 수행합니다. 도금된 세포를 밤새 배양하여 바이러스 정량화를 위해 융합되도록 합니다.
2. 500μL의 무혈청 배지를 여러 마이크로 원심분리 튜브에 부분 표본으로 주입합니다. 무혈청 매체로 채워진 튜브에 담근 멸균 면봉을 삽입합니다. 면봉은 사용하기 전에 최소 5분 동안 담그고 적셔야 합니다.
3. 밑에 있는 배지를 방해하지 않고 감염된 돼지 각막 플레이트를 생물 안전 캐비닛으로 운반합니다. 젖은 면봉을 사용하여 과도한 압력을 가하지 않고 감염된 돼지 각막 중심에서 직경 5mm로 시계 방향으로 3회, 시계 반대 방향으로 3회 회전합니다.
4. 면봉을 무혈청 매체로 채워진 마이크로 원심분리기 튜브에 다시 삽입하고 시계 방향과 시계 반대 방향으로 5회 회전합니다. 면봉의 금속 끝은 마이크로 원심분리기 튜브에 완전히 맞고 뚜껑을 닫을 수 있도록 짧게 잘라야 합니다.
5. 면봉으로 닦은 면 팁이 들어 있는 마이크로 원심분리기 튜브를 와류 기계에 놓고 1분 동안 고속으로 소용돌이칩니다.
6. 이러한 샘플에 대해 플라크 분석을 통해 바이러스 정량화를 수행합니다.
   메모: 이 정량화 단계는 2일, 4일, 선택적으로 감염 후 6일에 수행해야 합니다.

2. 플라크 분석에 의한 바이러스 정량화

참고: 플라크 분석을 수행하려면 Vero 세포를 성장시켜 6웰 플레이트로 만들고 분석을 시작하기 전에 세포의 90% 포화도를 보장하십시오. 이 세포의 75cm² 플라스크를 사용하십시오. 아래의 모든 단계는 생물 안전 캐비닛 내에서 수행해야 합니다.

1. 배양 배지를 흡인시킨 후 플라스크에서 Vero 세포의 합류 단층을 10mL의 신선한 인산염 완충액 식염수(PBS)로 세척합니다. 첫 번째 세척 용액 세트를 흡입한 후 PBS로 세척 단계를 다시 한 번 반복합니다.
2. 세포 단층에 0.05% 트립신 1mL를 추가합니다. 플라스크를 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 육안으로 세포가 플라스크의 내부 표면에서 분리되었는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 플라스크를 다시 검사하기 전에 5분 더 기다리십시오. 세포가 분리된 것처럼 보이면 세포가 플라스크 표면에서 완전히 분리되도록 단층에 9mL의 전체 배지를 추가합니다.
3. 전체 배지와 함께 플라스크에서 모든 세포를 모아 15mL 원심분리 튜브에 넣습니다.
4. 플라크 분석에 사용되는 6개의 웰 플레이트의 모든 웰에 대해 원심분리기 튜브에서 300μL를 사용합니다. 6웰 플레이트의 각 웰에 2mL의 전체 배지를 채웁니다. 플레이트를 인큐베이터에 밤새 그대로 두어 플레이트가 자라서 각 웰에 합류 단층을 형성할 수 있도록 합니다.
5. 플라크 분석을 수행하려면 바이러스를 정량화하기 전에 샘플의 연속 희석을 수행해야 합니다.
6. ^10-8의 희석에 도달할 때까지 무혈청 배지를 사용하여 마이크로 원심분리 튜브에서 바이러스를 log101 배 희석합니다. ^10-3 희석시 6-well plate에서 세포의 성장 배지를 흡인 한 후 희석 1mL를 도금 된 세포의 단층으로 옮기면 이것이 감염 단계가 될 것입니다. 감염된 플레이트를 37°C 인큐베이터에서 2시간 동안 배양합니다.
7. 기존 감염 배지를 흡인하고, PBS로 부드럽게 두 번 세척하여 세포를 코팅하고, 웰당 메틸셀룰로오스가 함유된 배지 2mL를 6웰 모두에 추가합니다. 72 시간 동안 또는 플라크의 형성이 보일 때까지 배양하십시오. 플라크(plaque)는 세포 단층(cell monolayer)의 세포 사이에 작은 틈(small gap)을 형성하여 확인할 수 있습니다.
8. 벽을 안내 팁으로 사용하여 각 웰의 모서리에 1mL의 메탄올을 천천히 추가합니다. 6-well 플레이트를 실온에서 15분 동안 배양합니다. 세포 단층을 방해하거나 교반하지 않고 플레이트에서 각 웰의 내용물을 천천히 흡인합니다.
9. 1mL의 크리스털 바이올렛 작업 용액을 6웰 플레이트의 각 웰에 추가하여 모든 세포가 덮이도록 합니다. 6웰 플레이트를 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다. 크리스털 바이올렛 용액을 흡입하여 버리고 흡수성 종이 한 장에 웰을 건조시킵니다.
10. 시작 용액의 총 바이러스 함량을 정량화하기 위해 가장 높은 희석 웰에서 플라크의 수를 계산합니다. 이 과정을 두 번 반복하여 바이러스 역가를 확인합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
피하 주사 바늘 30g.	BD (영어)	305128
500mL 유리병.	토마스 사이언티픽	844027
Bio-Safety Level-2(BSL-2) 인증을 받은 생물 안전 작업대.	써모피셔 사이언티픽	헤라세이프 2030i
Calgiswab 6 "멸균 칼슘 알긴산 표준 면봉.	청교도	22029501
셀 스크레이퍼 - 25cm	바이올로직스 BE	전화: 70-1180, 70-1250
원심분리기 튜브
크리스탈 바이올렛	시그마 알드리치	C6158	파우더는 어두운 곳에 보관하십시오.
Dulbecco의 변형 독수리 매체 - DMEM	지브코	41966029	사용할 때까지 4 °C에서 보관하십시오
에탄올	시그마 알드리치	E7023
소 태아 세럼 -FBS	시그마 알드리치	F2442	50mL 튜브에 분취하고 사용할 때까지 냉동 보관하십시오
베로 세포	아메리칸 타입 컬처 컬렉션 ATCC	CRL-1586
와류 기계
메탄올
메틸셀룰로오스
마이크로 원심분리기 튜브
돼지 각막	Park Packaging Co., 일리노이주 시카고		요청에 의한 특별 주문
절차 벤치 커버 - 필요에 따라.	써모피셔 사이언티픽	S42400
혈청학적 피펫	토마스 사이언티픽	P7132, P7127, P7128, P7129, P7137
혈청학적 피펫팅 장비.	토마스 사이언티픽	이즈펫 프로
입체경	칼 자이스	SteREO 디스커버리 V20
조직 배양 플라스크, T175 cm2.	토마스 사이언티픽	T1275
5% CO2 및 37°C 온도를 유지할 수 있는 조직 배양 인큐베이터	써모피셔 사이언티픽	포마 50145523
조직 배양 처리 플레이트(6-well).	토마스 사이언티픽	T1006
트립신

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