바이러스에 감염된 세포에서 다미생물 생물막 개시를 결정하기 위한 분석

초록

출처: Plotkin, B. J. et al., Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi. J. Vis. 특급 (2016)

이 비디오는 박테리아와 곰팡이에 의해 바이러스에 감염된 세포에서 다미생물 생물막 형성이 시작되는 것을 보여줍니다. 단순 포진 바이러스 감염은 세포에 대한 박테리아 부착을 방해하여 박테리아-진균 공동 국소화를 방지합니다. 대조적으로, 감염되지 않은 세포는 박테리아-진균 공동 국소화 및 생물막 형성 시작을 나타냅니다.

프로토콜

1. HSV 변형 및 처리

참고: 베타-갈락토시다아제 리포터 활성을 가진 재조합 비확산 HSV-1(KOS) gL86 및 HSV-2(KOS) 333gJ^-가 분석에 사용됩니다.

1. 단일 로트의 바이러스를 사용하고 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)와 20% 소 태아 혈청(FBS) 및 탈지유를 1:1 비율로 -80°C에서 사용할 때까지 보관하십시오. 바이러스 로트를 보관하기 전에 o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG) 및 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside(X-Gal) 분석으로 바이러스 농도를 측정합니다.
2. 앞서 설명한 바와 같이 리포터 바이러스 진입 분석을 사용하여 실행된 각 실험 분석에 대해 X-Gal 염색을 통해 바이러스 생존력 및 감염 다중성(MOI)을 측정합니다(그림 1).
3. 바이러스(Opt-MEM)를 원하는 MOI로 희석합니다. 염색하기 전에 단층(파라포름알데히드, 0.5ml/well)을 고정합니다. 바이러스 생존도 대조군을 polymicrobial assay plate와 병렬로 별도의 microtiter plate에 배치합니다.

2. HeLa 299 세포 처리

1. 4.5g/L 포도당, 10% 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS), 겐타마이신(50μg/ml) 및 L-글루타민을 사용하여 DMEM에서 37°C, 5% CO₂에서 성장합니다. 트립신 용액(에틸렌디아민테트라아세트산, 0.53M EDTA, 0.05% 트립신, 5ml/플라스크)과 80% 합류하는 계대 세포.

3. C. 알비칸스 취급

참고: 임상 실험실에서 얻은 C. albicans는 Remmel 탈지유 2x 배지에 -80 °C에서 보관됩니다.

1. Sabouraud 포도당 배지 (37 ° C)에 배양 동결 재고. 24 시간 후 C. albicans를 Fungisel 배지 (37 ° C, 48 시간)에 사용하여 사용합니다.
2. 생식관(GT) 형태를 생성합니다(대표 콜로니 선택; 3ml FBS; 3시간; 37°C; 흡광도₆₀₀(Abs₆₀₀), 0.3). 배양 후 GT(Hanks' Balanced Salt Solution, HBSS; 2x, 4,000 x g)를 세척합니다. 워싱된 GT를 예열된 HBSS(37°C, 0.32Abs₆₀₀)에 추가합니다. GT 형태는 혈구계 수에 의해 결정된 바와 같이 관찰된 세포의 99%여야 합니다.
3. 대표적인 곰팡이 군집(HBSS, 3 ml, 0.32 Abs₆₀₀)을 선택하여 효모 형태(YF) 스톡 현탁액을 만듭니다. 혈구계를 사용하여 현미경으로 YF 양식/ml의 수를 계산합니다. YF 형태는 혈구계 수에 의해 결정된 대로 관찰된 세포의 99%여야 합니다.
4. 작업 곰팡이 스톡 만들기 (25 ml HBSS, 37 ° C, 10⁵ 콜로니 형성 단위, (CFU / ml)에 GT 또는 YF 스톡 250 μl를 만듭니다.

4. S. aureus 취급

1. Store S. aureus American Type Culture Collection, ATCC 25923 (-80 °C; Remmel 탈지유 2x). 양의 혈액 한천 (5 %, 37 ° C, 24 시간)에 배양. 대표적인 콜로니를 선택하고 재고를 위해 2일 이내에 만니톨 염 배지로 옮깁니다(37°C, 18시간).
2. S. aureus 스톡 현탁액(3ml HBSS; 1.32 Abs_{600 ;}10⁸ CFU/ml)
   1. 작업 S. aureus 스톡(25ml HBSS에 스톡의 100μl, 10^5CFU/ml)을 만듭니다.

5. 칸디다 및 S. 아우레우스 현탁액

1. C. albicans와 S. aureus 현탁액(25ml HBSS에 250μl YF 또는 GT 스톡 및 100μl S. aureus 스톡)을 혼합하여 만듭니다.

6. 폴리미생물 생물막 분석

1. 200 μl의 2 x 10⁵ HeLa 세포/ml(85% 합류 수준)로 96웰 플레이트를 시드합니다. 배양 전 암석 플레이트 (30-45 분, 37 ° C) (37 ° C, 5 % CO₂ 인큐베이터, 18 시간). 단층 세척(1x; Opt-MEM)을 100μl Opt-MEM에서 HSV(HSV-1(KOS) gL86 또는 HSV-2(KOS) 33gJ^-로 파종합니다. MOI 50 및 10). 플레이트를 배양합니다 (3 시간, 37 ° C, 5 % CO₂). 하루에 하나의 바이러스 균주만 사용하십시오.
2. 감염된 단층(1x, Mg⁺² 및 Ca⁺²를 함유한 인산염 완충 식염수(PBS), 100μl)을 세척합니다. PBS를 각 웰에 25μl를 남기는 따뜻한 HBSS로 교체합니다.
   1. 표 1에 표시된 대로 YF, GT 및/또는 S. aureus 작업 현탁액(100μl, 목표 대 세포 비율 =5:1, n=16)을 추가합니다. 플레이트를 배양합니다 (정적, 30 분, 37 ° C, 5 % CO₂).
3. 배양 후 한 번에 하나의 컬럼을 흡입하고 즉시 Mg⁺² 및 Ca⁺²로 300μl PBS를 다시 채웁니다. 이 단계를 두 번 반복한 다음 방사선 면역침전 분석 용해 완충액(RIPA, 필터 멸균, 200μl의 1:50 희석)을 추가합니다.
4. HeLa 세포 용해물을 빠르게 분쇄한 다음 50μl를 만니톨 염(MS) 및/또는 곰팡이(F) 배지에 놓습니다(그림 2). 90° 각도로 구부린 유리 막대를 사용하여 용해물을 펴십시오. 플레이트를 배양합니다(37°C에서 18시간). 플레이트당 콜로니 수를 수동으로 계산합니다. 대조군은 S. aureus 및/또는 C. albicans가 HSV에 감염되지 않은 HeLa 세포를 준수하는 것으로 구성됩니다.

표 1. Polymicrobial Interactions에서 미생물 부착에 대한 일반적인 템플릿 측정.GT= 칸디다 알비칸스 생식관 표현형; YF= C. albicans 효모 형태 표현형; MSSA = 메티실린 민감성 황색포도상구균; MS= 만니톨 염 배지; F= 곰팡이 배지.

결과

그림 1. HeLa 세포의 용량 의존적 HSV-1 감염에 대한 X-gal 염색 사진.다양한 MOI에서 HSV-1에 감염된 HeLa 세포 및 X-Gal 염색. (A) X-Gal 염색 모의 감염 HeLa 세포 대조군이 있는 96 웰 플레이트의 웰 내 HeLa 세포; 20x 초기 배율; (B) 10의 감염 다중성(MOI)으로 HSV-1에 감염된 X-Gal 염색 HeLa 세포가 있는 96웰 플레이트의 웰 내 HeLa 세포; 20x 초기 배율; (C) 50의 감염 다중성(MOI)으로 HSV-1에 감염된 X-Gal 염색 HeLa 세포가 있는 96웰 플레이트의 웰 내 HeLa 세포; 20x 초기 배율; 축척 막대는 모두에 적용됩니다.

...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C.알비칸스
BBL 사부로 덱스트로스	BD (영어)	211584
곰팡이 한천	닷 사이언티픽	7205ᅡ
S.아우레우스
만니톨 소금 한천	트로이 바이오로직스	7143B
양 피 한천	트로이 바이오로직스	221239
헬라 세포
1xDMEM(Dubelcco의 변형 이글 배지, 4.5g/L 포도당 및 L-글루타민, 피루브산 나트륨 제외	코 닝	10-017-CM
겐타마이신 50mg/ml	시그마	1397	전체 DMEM에서 50μg/ml의 최종 농도
트립신 EDTA (0.05% 트립신, 0.53M EDTA)용액 1X	코 닝	25-052-CI
소 태아 세럼	애틀랜타 바이오로직스	S11150	전체 DMEM에서 10%의 최종 농도
다른 배지 및 시약
온페이지	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	34055
울트라 퓨어 X gal	인비트로젠	제15520-018
HBSS(행크스 밸런스드 솔트 솔루션) 1개	코 닝	20-021-이력서
1XPBS	닷 사이언티픽	30042-500
RIPA 용해	생명 기술	89901
공급
96웰 플레이트	에버그린 사이언티픽	222-8030-01F
배양 튜브 100x13	토마스 사이언티픽	9187L61

) 년 ) 호 년