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1. 솔루션 및 미디어
- 표 1에 따라 2X Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 배지, 인산염 완충 식염수(PBS), Sabouraud 포도당 육수 및 Sabouraud 포도당 한천을 준비합니다.
2. 곰팡이 접종 성장 조건
- 모든 곰팡이 균주는 필요할 때까지 -80 °C에서 35% 글리세롤에 냉동 재고로 보관하십시오.
- 각 실험 전에 다음 단계를 수행합니다.
- 칸디다 알비칸스 균주의 경우:
- 스톡 바이알을 해동하고 200μL를 10mL의 Sabouraud 포도당 육수를 캡이 있는 멸균 50mL 폴리프로필렌 튜브에 넣고 교반(200rpm)하면서 30°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 튜브를 기울이고 배양을 더 잘 통기할 수 있도록 캡을 약간 열어 두는 것을 잊지 마십시오.
- Cryptococcus neoformans 균주의 경우 :
- 스톡 바이알의 얼어붙은 표면을 긁어냅니다. 세포를 Sabouraud 포도당 한천 플레이트에 플레이트하고 30°C에서 48시간 동안 배양합니다. 고립된 집락이 눈에 띄게 성장한 후에는 플레이트를 파라핀 필름으로 밀봉된 냉장고(4°C)에 최대 15일 동안 보관하십시오.
- 멸균 이쑤시개 또는 멸균 접종 루프를 사용하여 플레이트에서 중간 크기의 분리 콜로니를 수집하고 멸균 50mL 원뿔형 튜브에 10mL의 Sabouraud 포도당 육수를 접종합니다. 교반(200rpm)하에서 30°C에서 약 24시간 동안 배양합니다.
- 24시간 배양을 초과하지 마십시오. 더 나은 통기를 위해 튜브를 기울이고 캡을 약간 열어 두는 것을 잊지 마십시오. 항생제 내성에 영향을 미치는 중요한 요소이므로 각 검사 전에 세포의 성장 단계를 표준화하는 것이 항상 좋습니다.
메모: 두 곰팡이 모두 실험에서 빠른 번식을 위해 30°C에서 성장했지만 임상 치료(37°C)와 같은 연구 목적을 반영하기 위해 온도를 변경할 수 있습니다. 가장 중요한 것은 각 곰팡이 분리물에 대해 이 초기 배양 시간을 미리 설정하고 재현성을 보장하기 위해 모든 테스트 전반에 걸쳐 유지해야 한다는 것입니다.
- 곰팡이 성장 후 실온에서 1,200 x g의 원뿔형 튜브를 5분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다. 상등액을 버리고 PBS 10mL를 첨가합니다.
- 세포를 재현탁시키고 실온에서 1,200 x g에서 5분 동안 다시 원심분리합니다.
- PBS 세척 및 원심분리를 두 번 더 반복합니다. 세 번째 세척 후 2X RPMI-1640 배지 5mL(펠릿 크기에 따라)에 세포를 재현탁합니다.
- 마이크로 원심분리 튜브에 1:100 또는 1:1,000 희석 1mL를 준비합니다(세포 현탁액의 탁도에 따라 다름).
- 이 희석액을 10μL씩 분취하여 혈구계 챔버에 넣고 현미경으로 4개의 모서리 사분면에 있는 총 세포 수를 계산합니다. (총 세포 수/4) x 희석 계수 x 104(챔버 희석 상수) 공식으로 농도를 계산합니다.
- 생존 능력이 계산되고 성장 조건이 연구 중인 분리체에 대해 체계적으로 상관된 경우 100% 생존 가능성을 고려하십시오.
메모: 생존 계수의 표준화 및 품질 관리는 효모에 대한 EUCAST(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing)의 항진균성 최소 억제 농도(MIC) 방법에 따라 백플레이팅을 통해 수행할 수 있습니다.
- 연구 중인 분리물에 대한 성장/생존력 상관관계가 설정되지 않은 경우 phloxine B11, trypan blue 또는 Janus Green과 같은 죽은 세포를 선택적으로 착색하는 염료를 사용하여 혈구계에서 살아있는 세포를 계수하여 곰팡이 생존력을 측정합니다.이 시점에서 개체군의 생존율이 90% 이상인 경우에만 이 프로토콜에 곰팡이 세포를 사용하십시오.
참고: Dead/alive 염료는 선택한 곰팡이와 잘 작동하지 않을 수 있습니다. 사용하기 전에 테스트하십시오. 예를 들어, 트리판 블루 염료는 C. neoformans와 잘 작동하지 않습니다.
- 그 후, 2X RPMI-1640 배지(RPMI-1640 배지에서 2X 조정 접종물)에서 세포 현탁액을 준비합니다. 96웰 플레이트의 경우 각 플레이트에 대해 5mL의 부피를 고려하십시오.
- 모든 C. albicans 균주에 대해 4 x 103 cells/mL의 스톡 세포 현탁액을 준비합니다. 이 농도는 각 웰의 최종 세포 농도의 2배입니다(2 x 10,3 cells/mL).
- C. neoformans 균주의 경우 세포 2 x 104 cells/mL의 스톡 배양물을 준비합니다. 이 농도는 각 웰의 최종 세포 농도(1 x 10,4 cells/mL)의 두 배입니다.
- 다른 곰팡이의 경우, 배양 시간과 관련하여 특정 연구에 이상적인 농도가 알려진 항진균제로 테스트하십시오. 곰팡이의 신진대사와 복제 시간을 고려하십시오.
3. 펩타이드(알 수 없는 물질)
- 동결건조된 펩타이드를 -20°C에서 보관하고 각 실험 전에 탈이온수에 용해시킵니다. 물에 용해된 후 최대 보관 시간은 각 펩타이드의 특성에 따라 다릅니다.
- 분석에서 테스트된 가장 높은 최종 농도의 두 배인 부분 표본을 준비합니다(2X). 이상적으로는 동결-해동 주기를 피하기 위해 한 번 사용할 수 있는 충분한 펩타이드가 함유된 소량의 부분 표본을 준비하는 것이 좋습니다.
메모: 농도의 선택은 문헌과 펩타이드의 특성을 기반으로 해야 합니다. 약 100μM의 펩타이드로 연속 희석을 시작한 다음 얻은 결과에 따라 이 농도 범위를 줄이거나 늘리는 것이 좋습니다.
4. 참조 항진균제(양성 대조군)
- 물에 희석된 경우: 분석 농도가 가장 높은 2X 용액을 준비합니다(희석 단계는 섹션 5: 항진균 분석 참조).
- C. albicans 균주의 경우 128μg/mL의 플루코나졸 또는 128μg/mL의 카스포펀진 용액을 준비합니다. 둘 다에 대한 플레이트 농도는 64μg/mL입니다.
- C. neoformans 균주의 경우 32μg/mL의 암포테리신 B(수용성 용액) 용액을 준비합니다. 플레이트 농도는 16μg/mL.
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참고 : 일반적으로 암포테리신 B는 디메틸 설폭사이드 (DMSO)에 희석되는데,이 항진균제는 물에 잘 녹지 않기 때문입니다. 그러나, 상업적으로 이용 가능한 수용성 암포테리신 B 제제가 있습니다.
- 유기 용매에 희석된 항진균제의 경우: DMSO에서 100X 원액을 준비한 다음 물에 10X로 희석하여 사용합니다.
메모: 따라서 웰에서 DMSO의 최종 농도는 1%를 초과하지 않습니다. 곰팡이가 1% DMSO를 포함하는 배지에서 자랄 우물은 일부 곰팡이가 이 용매 농도를 잘 견디지 못한다는 점을 감안할 때 방제가 필요합니다. DMSO는 감광성이므로 플레이트를 호일로 덮거나 배양 기간 동안 어두운 챔버에 두십시오.
5. 항진균 분석
참고: 체외 항진균 분석은 CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute) M27-A3 지침의 국물 미세 희석 감수성 테스트를 기반으로 수행되며 일부 수정이 있습니다.
- 각 펩타이드의 2배 연속 희석을 준비하고 96웰 폴리스티렌 마이크로플레이트에서 항진균제를 최종 부피 50μL까지 제어합니다.
- 피펫을 사용하여 원하는 가장 높은 최종 농도의 2X 농도로 항진균/펩타이드 100μL를 A열의 1-3열에 추가합니다.
- 멀티채널 피펫을 사용하여 50μL의 멸균수를 B열에서 H열까지의 다른 웰에 추가합니다.
- 농도가 가장 높은 웰(A행)을 50μL씩 제거하고, 다음 농도의 다음 웰(B행)로 옮기고 균질화합니다.
- 농도가 가장 낮은 웰이 될 때까지 위의 단계를 반복하고 이 웰 50μL(H 행)를 버립니다. 11열과 12열(행 A, B, C)은 빈 제어 또는 음수/성장 제어를 위해 물만 남겨 둡니다.
- RPMI-1640 배지의 2X 조정된 접종물 50μL를 각 웰(열 1-3 및 열 11(음성/성장 대조군))에 추가합니다. C. albicans의 최종 농도는 2 x 103 cells/mL이고 C. neoformans 균주의 최종 농도는 104 cells/mL입니다.
- 블랭크 대조군(50μL 물 + 50μL 2X RPMI-1640 배지, 세포 없음) 및 음성/성장 대조군(50μL 물 + 50μL 조정 접종물 2X RPMI-1640 배지, 항진균제가 없는 배지)을 준비하고 위에서 설명한 대로 웰 플레이트에 로드합니다.
- 테스트할 각 화합물과 선택한 항진균 대조군(4-10열)에 대해 절차를 반복합니다.
메모: 연속 희석은 아래 실험과 같이 수직으로 수행하거나 플레이트에서 수평으로 수행할 수 있습니다(즉, 테스트해야 하는 주어진 화합물/추출물의 희석 수가 8개 이상인 경우).
- 화합물, 참조 약물 또는 그 성분이 감광성인 경우 감소된 조명에서 분석을 수행하거나, 플레이트를 호일로 덮거나, 배양 중에 어두운 챔버에 두십시오.
- 다음과 같은 선택적 권장 사항을 고려합니다.
- 가스 교환을 허용하는 투명한 덮개 플레이트로 플레이트를 밀봉하면 증발을 줄이는 데 도움이 됩니다.
- 플레이트를 습한 챔버에 놓으십시오.그것은 또한 증발을 줄이는 데 도움이 될 것입니다.
- 모든 C. albicans 균주의 경우 37°C에서 24시간 또는 48시간 동안 플레이트를 배양하고 C. neoformans의 경우 200rpm 진탕으로 48시간 동안 플레이트를 배양합니다. 최종 부피가 낮을수록(100 μL) 스필오버가 발생하지 않습니다.
메모: C. albicans 균주에 대한 24시간과 48시간의 MIC 판독값 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았습니다. 그럼에도 불구하고 48시간에서의 판독값은 시각화하기가 더 쉽습니다.
- 도립 광학 현미경의 도움을 받아 잠복기 전과 후에 모든 웰을 관찰하여 형태의 변화를 확인하고 오염 징후를 확인합니다.
메모: 판독은 시각적으로 수행하고 실험이 끝날 때 사진을 찍을 수 있습니다. 각 판독 전에 플레이트를 약간 균질화하십시오. 판독은 세포 덩어리 또는 필라멘트화가 관찰되지 않는 경우 600nm에서 OD를 측정하여 수행할 수도 있습니다.
- 서로 다른 날짜에 최소 3회 이상 실험을 수행합니다.
표 1. 배지 및 시약 준비.
| 보통 | 준비 |
| 2X Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 미디엄 – 500 mL | RPMI-1640 10.4g(L-글루타민 및 페놀 레드 보충, 중탄산염 제외) |
| 330mM 3-(N-모르폴리노) 프로판 설폰산(MOPS) |
| NaOH로 pH 7.0으로 조정 |
| 여과에 의한 살균(0.22μM 필터) |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | 137mM 나트륨 |
| 2.7 밀리엠 KCl |
| 10 mM Na2HPO4 |
| 2 mM 킬로2PO4 |
| 121°C에서 15분 동안 오토클레이브합니다. |
| Sabouraud 포도당 육수 | 증류수 500mL에 분말 15g을 넣으십시오. |
| NaOH로 pH 7.0으로 조정 |
| 121°C에서 15분 동안 오토클레이브합니다. |
| Sabouraud 포도당 한천 | 증류수 500mL에 분말 32.5g을 넣는다. |
| NaOH로 pH 7.0으로 조정 |
| 121°C에서 15분 동안 오토클레이브합니다. |