항생제 투여 시 세균 생존율을 결정하기 위한 ATP 활용 분석

초록

출처: Wang, Liang-Chun 등 ATP 활용 상용 분석 및 생/사멸 염색을 사용한 Neisseria gonorrhoeae 응집체의 항생제 감수성에 대한 정량적 검사. J. Vis. 특급 (2019).

이 동영상은 루시페라아제 글로우 시약을 사용한 간단한 ATP 측정 분석에 대해 설명합니다. 이 분석법은 세프트리악손 치료 후 Neisseria gonorrhoeae 생존을 정량화하는 데 사용됩니다.

프로토콜

1. GC 응집의 생존력 정량화

1. 멸균 애플리케이터를 사용하여 GC를 수집합니다. 플레이트에서 GC를 면봉으로 닦고 4.2% NaHCO₃ 및 1% Kellogg 용액이 보충된 예열 육수(GCP, 표 1)에 GC를 다시 현탁시킵니다. 650nm(OD 650 1 = ~1 x 10⁹ CFU/mL)의 파장에서 분광 광도법을 사용하여 부유 박테리아의 농도를 측정합니다.
2. GC 농도를 ~1 x 10⁸ CFU/mL로 조정합니다.
3. 99μL의 조정된 GC 현탁액을 96웰 플레이트의 웰에 추가합니다.
4. 박테리아가 응집될 수 있도록 37°C에서 6시간 동안 플레이트를 5% CO₂로 배양합니다.
5. 각 웰에 1μL의 연속 희석 세프트리악손(1000, 100, 50, 25, 12.5, 6.2, 3.1, 1.5, 0.8, 0.4, 0.2μg/mL)을 추가합니다. 일부 우물은 대조군 역할을 하기 위해 처리되지 않은 상태로 두십시오.
6. 플레이트를 37 ° C에서 24 시간 동안 5 % CO₂로 배양합니다.
7. 144W 및 20kHz에서 5초 동안 각 웰에서 서스펜션을 3번 초음파 처리합니다.
8. 각 웰에 시판되는 ATP 활용 글로우 시약 100μL를 추가하고, 3회 위아래로 피펫팅하고, 5%_CO2로 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
9. 각 웰에서 150μL의 혼합물을 96웰 블랙 마이크로플레이트의 새 웰로 조심스럽게 옮기고 기포가 생기지 않도록 합니다.
10. 플레이트 리더를 사용하여 560nm에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다.
11. 연속 세프트리악손 처리 후 얻은 판독값과 처리되지 않은 우물의 판독값의 비율로 생존율을 계산합니다.

2. GC 응집체의 Live/Dead에 대한 형광 현미경 분석

1. 멸균 애플리케이터를 사용하여 GC를 수집합니다. 플레이트에서 GC를 면봉으로 채취하고 예열된 GCP 배지와 1% Kellogg 보충제에 GC를 다시 현탁시킵니다.
2. 650nm의 파장에서 분광 광도법으로 박테리아 수를 측정하고 GC 농도를 ~1 x 10⁷ CFU/mL로 조정합니다.
3. 198 μL의 GC 현탁액을 8-well 커버슬립 바닥 챔버에 추가합니다.
4. 응집 형성을 허용하기 위해 37 ° C에서 6 시간 동안 챔버를 5 % CO₂로 배양합니다.
5. 각 응집 조건 내에서 각 웰에 2μL의 세프트리악손(100μg/mL 또는 다양한 희석액)을 추가합니다. 37 ° C에서 5 % CO₂로 원하는 시간 동안 배양합니다.
6. 각 웰에 0.6 μL의 살아있는/죽은 염색 용액 혼합물을 추가하고 5% CO₂로 37 °C에서 20분 동안 배양합니다.
7. 컨포칼 현미경을 사용하여 Z-시리즈 이미지를 획득합니다(동등한 현미경을 사용할 수 있음).
8. GC 응집체의 크기와 각 응집체에서 살아있는 염색과 죽은 염색의 형광 강도 비율 FIR을 측정하기 위해 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석합니다.

표 1: GCP 박테리아 성장 배지 1L의 레시피.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
켈로그 보충제 100개
한천	미국 생물학	A0930
BacTiter 어세이	프로메가	G8232 (영문
세프트리악손	티씨아이	C2226
Difco GC 미디엄 베이스	BD (영어)	228950
질산철, 비수화물	시그마-알드리치	254223-10지
포도당	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	BP350-1
BacLight 생염색/사염색	인비트로젠	L7012
MS11 Neisseria 임질 균주			Walter Reed Army Institute for Research의 Herman Schneider 박사가 친절하게 제공합니다.
초음파 처리기	콘테스		9110001와 동일

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