Determining the Role of Neutrophil-like cells in Lymphoma cell: test drug (림프종에서 호중구 유사 세포의 역할: 시험 약물에 대한 민감성)

초록

출처: Hirz, T., et al. 치료제에 대한 림프종 세포 민감성에서 그들의 역할을 결정하기 위한 호중구 분리 및 분석. J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 화학요법제의 세포독성으로부터 림프종 세포를 보호하는 호중구 유사 세포의 역할을 조사하는 분석을 보여줍니다. 림프종과 호중구 유사 세포로 구성된 3D 공동 배양이 이루어지고 화학 요법 약물인 빈크리스틴에 노출됩니다. 호중구 유사 세포와 직접 접촉하면 림프종 세포에서 항세포사멸 단백질의 상향 조절을 유도하여 빈크리스틴이 있는 상태에서 생존을 촉진합니다.

프로토콜

1. 과립구 경로를 따른 HL60 세포의 분화 및 3D 모델에서 RL 림프종 B 세포와의 공동 배양

1. 인간 전골수구(HL60) 세포를 호중구 유사 세포로 분화
   1. HL60 세포 수를 3 x 10⁵ cells/ml로 조정한 다음 1μM 레티노산(RA)과 1.25% DMSO를 첨가하여 분화를 유도합니다. 48-well 플레이트에 웰당 각 3 x 10⁵ HL60 세포를 시딩한 다음 5% CO₂로 37°C에서 48시간 동안 배양합니다.
   2. 그 후, 세포를 수집하고 RT에서 5분 동안 300g으로 원심분리합니다. 세포 생존율 계수기를 사용하여 계수하기 위해 완전한 RPMI 배지로 세포를 재현탁합니다.
   3. 그런 다음 HL60 세포 수를 3 x 10⁵ cells/ml로 조정하고 1μM 레티노산(RA) 및 1.25% 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 첨가하여 세포 현탁액을 완전히 RPMI 배지로 희석합니다. 48-well 플레이트에 웰당 각 3 x 10⁵ HL60 세포를 파종하고 5% CO₂로 37°C에서 48시간 동안 추가로 배양합니다.
2. HL60 분화 분석(HL60diff)
   1. 세포를 수집하고 RT에서 5분 동안 300g의 튜브를 원심분리합니다. 세포 생존율 카운터를 사용하여 계수하기 위해 완전한 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 배지로 펠릿을 재현탁합니다.
   2. 유세포 분석에 의한 세포 표면 마커 발현의 변화를 분석합니다. 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석을 위해 각 3 x 10⁵ 미분화 HL60 세포(세포 배양에서)와 3 x 10⁵ HL60diff 세포를 5ml 플라스틱 튜브에 넣고 RT에서 5분 동안 300g에서 튜브를 원심분리합니다.
   3. 펠릿을 50μl 인산염 완충 식염수(PBS)-소 태아 혈청(FBS)(4%)에 재현탁합니다. AF700에 접합된 항인간 CD11b 또는 APC에 접합된 항인간 CD38(5 μl/10⁶ 세포)로 세포를 라벨링합니다. 4 ^oC에서 30 분 동안 어두운 곳에서 세포를 배양하십시오.
   4. 500μl PBS-FBS(4%)로 세척한 다음 RT에서 300g에서 5분 동안 원심분리합니다.펠릿을 200μl PBS-FBS(4%)에 재현탁합니다.
   5. 그림 1A의 게이팅 전략과 다음 광학 구성을 사용하여 유세포 분석기에서 분석합니다: 488nm 레이저: FSC-A(488nM), SSC-A(488/10BP); 633nm 레이저: APC(660/20BP), Alexa Fluor 700(730/45BP).
   6. HL60diff의 형태학적 변화를 테스트하려면 현미경 검사를 위해 세포를 유리 슬라이드에 고정시킵니다.
      1. 이를 위해 각 3 x 10⁴ 미분화 HL60 세포(세포 배양에서) 및 3 x 10⁴ HL60diff를 150 μl 완전 RPMI 배지에서 재현탁합니다. 유리 슬라이드, 필터 카드 및 시료 챔버를 cytospin 원심분리기에 조립하여 원심분리기의 균형을 유지합니다.
      2. 각 세포 유형을 시료 챔버에 넣고 RT에서 10분 동안 1,500rpm으로 세포 원심분리를 합니다.원심분리기에서 슬라이드, 필터 카드 및 시료 챔버를 제거합니다. 슬라이드의 셀이 손상되지 않도록 조심스럽게 분해하십시오. 필터 카드와 시료 챔버는 폐기합니다.
      3. Giemsa 염색 키트를 사용하여 세포를 염색하고 슬라이드를 1시간 동안 건조시킵니다. 100X 배율로 현미경으로 세포를 검사합니다.
3. 3차원(3D) 문화
   메모: 이 실험에 사용된 재료가 차갑고 실험이 얼음 위에서 진행되고 있는지 확인하십시오.
   1. 각 5 x 10⁴ RL 세포를 단독으로 또는 RL:HL60diff 1:10 비율로 HL60diff와 혼합하여 300 μl 기저 멤브레인 매트릭스와 함께 재부유탁하여 개구부를 약 2 - 3mm로 넓히기 위해 멸균 가위로 절단한 1ml 피펫 팁을 사용합니다.이 단계에서 기포를 피합니다.
   2. 각 300μl의 세포 현탁액/웰을 24웰 플레이트에 파종합니다. 이 단계에서 거품을 피하십시오. 플레이트를 37°C에서 5% CO₂로 30분 동안 배양한 다음 각 웰에 대해 1ml의 완전한 RPMI 배지를 추가하고 5% CO₂로 37°C에서 7일 동안 배양합니다. 이틀에 한 번씩 매체를 교체하십시오. 5일째에 10nM 빈크리스틴을 첨가합니다.
4. FACS 분석
   1. 배양 7일 후, 배지를 흡인하고 1ml의 얼음처럼 차가운 PBS로 각각 두 번 잘 씻습니다. 얼음처럼 차가운 PBS-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 3ml/웰(5mM)을 추가합니다. 200μl 피펫 팁의 바닥을 사용하여 웰 바닥에서 젤을 분리합니다. 접시를 얼음 위에서 30분 동안 부드럽게 흔듭니다.
   2. 세포 현탁액을 멸균 15ml 튜브로 옮기고 얼음 위에서 튜브를 30분 더 부드럽게 흔듭니다. 균질한 세포 현탁액이 나타나는지 확인합니다. (그렇지 않은 경우 세포를 더 오래 흔들거나 PBS-EDTA를 더 추가하십시오.)
   3. RT에서 10분 동안 300 x g에서 튜브를 원심분리하고, PBS로 펠릿을 세척한 다음 300 x g에서 RT에서 10분 동안 원심분리합니다.
   4. PBS-FBS(4%)로 재현탁하고 PE-Cy7에 접합된 항인간 CD19 항체 및 APC(5μl/10,⁶세포)에 접합된 항인간 CD38 항체로 표지합니다. 4 ^oC에서 30 분 동안 어두운 곳에서 배양하십시오.
   5. 500μl PBS-FBS(4%)로 세척한 다음 RT에서 5분 동안 300g의 원심분리 튜브로 세척합니다. 상용 키트를 사용하여 Annexin V 및 PI로 세포를 재현탁합니다.
   6. 그림 2A의 게이팅 전략과 다음 광학 구성을 사용하여 유세포 분석기에서 분석합니다: 488nm 레이저: FSC-A(488nM), SSC-A(488/10BP), FITC(530/30BP), PI(610/20BP), PE-Cy7(780/60BP); 633nm 레이저: APC(660/20BP). 색상 보정을 확인하십시오.

결과

그림 1. 분화된 HL60 셀의 구조적 매개변수. (A) 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC) 플롯은 HL60 및 분화된 HL60 세포(HL60diff)를 나타냅니다.(B) HL60 및 HL60diff 세포는 anti-CD11b-AF700 또는 anti-CD38-APC로 표지된 후 유세포 분석을 수행했습니다. FSC-A 대 SSC-A 산점도(A)에서 각 세포 집단에 대한 게이팅 후, CD11b 또는 CD38의 발현에 대해 세포를 분석했습니다. (C) HL60 세포는 과립구로의 분화와 일치하는 형태학적 변화를 보여줍니다. 사진은 100X 배율로 현미경으로 촬영했습니...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RPMI 1640	Gibco Invitrogen	21875-034
소 태아 혈청(FBS)	Gibco Invitrogen	10270-106
인산염 완충 식염수(PBS에는 칼슘과 마그네슘이 함유되어 있음)	Gibco Invitrogen	제14040-091
빈크리스틴	예를 들면 labo
BD Matrigel 기저 멤브레인 매트릭스	BD 바이오사이언스	354234	실험 전날 밤새 4 oC에 두십시오.
디메틸설폭사이드(DMSO)	시그마-알드리치	D8418
레티노산	시그마-알드리치	R2625
소 혈청 알부민(BSA)	시그마-알드리치	A7906
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)	시그마-알드리치	E5134
부속 V-FLOUS 염색 키트	로슈	전화: 11 988 549 001
키트 RAL 555 변형 Giemsa 염색 키트	코스모스 바이오메디컬	CB361550-0000
LSRII 유세포 분석	BD 바이오사이언스
세포원심분리기	써모 사이언티픽(Thermo Scientific
Leica DMR-XA 현미경	라이카 마이크로시스템즈
Cellometer Auto T4 세포 생존도 카운터	Nexcelom 생명과학

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