동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. C57BL/6 마우스에 T Ag 발현 종양 세포 접종
- SV40 형질전환된 섬유육종 세포주 C57SV(또는 유사한 T Ag+ 부착 세포주)를 Dulbecco의 변형된 독수리 배지(DMEM)에서 4.5g/L D-글루코스 및 L-글루타민(1x)으로 성장시키고 10% 피루브산나트륨 및 10% 열비활성화 소 태아 혈청(FBS)을 10% 이산화탄소(CO2)를 함유한 가습 분위기에서 37°C의 조직 배양 처리된 플라스크에
보충합니다.
- 세포가 완전히 합류하거나 약간 과도하게 합류하면 배지를 부드럽게 제거하고 버리고 예열된 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 단층을 헹굽니다.
참고: 최대 T Ag 발현은 T Ag+ 세포가 100% 포화도에 도달할 때 달성됩니다.
- 생물 안전 캐비닛 내부에 예열된 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(트립신-EDTA)(0.25%)을 추가하여 세포가 패치로 제거될 때까지 실온에서 단층을 덮습니다. 배양 플라스크의 측면을 여러 번 두드려 남아 있는 부착 세포를 방출합니다.
참고: 필요한 경우 트립신화 과정을 신속하게 진행하기 위해 플라스크를 37°C 인큐베이터로 옮깁니다. 이탈된 세포는 광학 현미경 아래에서 빠르게 둥근 모양을 채택합니다. 이 단계는 약 5분 동안 지속됩니다.
- DMEM 배지 5mL를 추가하고 덩어리를 해리하여 각 플라스크의 내용물을 위아래로 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
- 70μm 공극이 있는 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 튜브로 이동합니다.
- 400 x g에서 4°C에서 5분 동안 튜브를 스핀다운합니다.
- 상등액을 버리십시오. 펠릿화된 세포를 10mL의 멸균된 차가운 PBS에 재현탁합니다.
- 1.6단계와 1.7단계를 두 번 반복합니다.
- 혈구계를 사용하여 세포를 계산합니다. 4 x 107 cells/mL 멸균 PBS를 함유하는 균일한 현탁액을 준비합니다.
- 위의 현탁액 500μL를 각 성인(6-12주령) 수컷 또는 암컷 C57BL/6 마우스에 복강내(i.p.)로 주입합니다.
2. 치료 요법
- TCD8 면역우성에 대한 nTreg 세포의 기여도를 조사하기 위한 치료 요법
- C57SV 세포를 가진 C57BL/6 마우스의 생체 내 프라이밍(in vivo priming) 4일 전(단계 1.10), nTreg 세포를 고갈시키는 0.5mg의 저내독소, 아지드가 없는 항-CD25 단일클론항체(mAb) 또는 랫드 IgG1 동형 대조군(예: 클론 KLH/G1-2-2, 클론 HRPN 또는 클론 TNP6A7)을 각 동물에 한 번씩 주입합니다.
- TCD8 면역우성 형성에서 프로그래밍된 세포 사멸 단백질(PD-1-PD-L1(2)) 상호 작용의 생체 내 중요성을 테스트하기 위한 치료 요법
참고: PD-L1에 의한 PD-1의 결합은 항상 그런 것은 아니지만 종종 Ag 특이적 TCD8의 공동 억제 및/또는 고갈을 중재합니다. 따라서 항 PD-L1 및 항 PD-L2 mAb의 투여와 병행하여 항 PD-1 치료를 수행하여 생물학적 현상과 관련된 정확한 세포 간 상호 작용을 밝힐 수 있습니다.
3. 타겟 비장 세포의 준비
- 자궁경부 탈구에 의해 비장 세포 기증자 역할을 할 성별이 일치하는 미숙한 C57BL/6 마우스(6-12주령)를 안락사시킵니다.
- 각 마우스의 복부가 위를 향하도록 생물학적 안전 캐비닛 안에 배치합니다. 70%(v/v) 에탄올인 EtOH를 피부에 분사합니다. 멸균 집게와 가위를 사용하여 피부를 들어 올리고 작은 복부 정중선을 절개합니다. 그런 다음 십자가 모양으로 피부를 잘라 복막을 드러냅니다.
- 집게를 사용하여 내부 장기를 낚아채지 않고 텐트와 같은 방식으로 복막을 당깁니다. 복막을 절개하여 복강을 드러내고 비장을 부드럽게 제거합니다.
- 15mL의 멸균 PBS가 들어 있는 5mL Dounce 티슈 그라인더에 비장을 넣습니다. 비장 조직이 빨간색의 균질한 세포 현탁액으로 소멸될 때까지 그라인더의 유리 플런저를 사용하여 수동 압력을 가합니다.
참고: 실험 그룹당 수용 동물의 수에 따라 표적 세포 준비를 위해 여러 개의 기증자 마우스 비장이 필요할 수 있습니다. 최대 3개의 비장을 15 mL 그라인더 내부에서 함께 균질화할 수 있습니다.
- 균질액을 15mL 튜브로 옮깁니다. 400 x g에서 4°C에서 5분 동안 튜브를 스핀다운합니다.
- 상등액을 버리십시오. 적혈구를 제거하기 위해 4mL의 암모늄-염화물-칼륨(ACK) 용해 완충액에 펠렛화된 세포를 4분 동안 재현탁합니다.
참고: 이 단계는 시간에 민감한 단계입니다. 비장세포를 ACK lysing buffer에 과도하게 노출시키면 취약성이 증가하고 비특이적 세포 사멸에 취약해집니다.
- 각 튜브에 10% 열 비활성화 FBS, L-알라닐-L-글루타민, 0.1mM 최소 필수 매체(MEM) 비필수 아미노산, 1mM 피루브산 나트륨, 10mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 및 1x 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 Roswell Park Memorial Institute 1640(RPMI 1640) 배지 8mL를 추가합니다. 이는 이후 완전한 RPMI 배지라고 합니다(재료 표).
- 세포 여과기의 70μm 공극을 통해 내용물을 새로운 15mL 튜브로 옮깁니다.
- 400 x g에서 4°C에서 5분 동안 튜브를 스핀다운합니다.
- 상등액을 버리십시오. 펠릿화된 세포를 12mL의 완전한 RPMI로 재현탁합니다.
- 비장세포 현탁액을 3개의 튜브에서 3개의 동일한 부분(각 4mL)으로 분할합니다.
4. 관련성이 없는 동족 펩타이드로 코팅 타겟 비장 세포
- 표적 비장세포의 펄스를 측정하는 데 사용될 펩타이드에 따라 튜브에 라벨을 붙입니다. 대조군 비장세포는 관련 없는 펩타이드로 펄스되며, 동족 표적 비장세포의 각 집단은 T Ag 유래 면역우성 에피토프(부위 IV) 또는 하위 우성 T Ag 에피토프(부위 I 또는 부위 II/III)에 해당하는 합성 펩타이드로 펄스됩니다(표 1).
참고: 관련 없는 펩타이드의 선택은 실험 설정과 각 조사에 사용된 마우스 균주에 따라 다릅니다. 저자는 종종 C57BL/6 마우스에서 gB498-505(단순 헤르페스 바이러스[HSV]-1의 H-2Kb 제한 면역우성 펩타이드 항원결정기) 및/또는 GP33-41(림프구성 융모수막염 바이러스([LCMV])의 H-2Db 제한 면역우성 펩타이드 항원결정기)를 사용합니다(표 1). 이러한 펩타이드는 다음과 같은 이유로 최적의 선택입니다: (i) 여기에 설명된 마우스 모델에서 이전에 발생하지 않은 병원체에서 유래합니다. (ii) T Ag-유래 펩티드와 유사하게, gB498-505 및 GP33-41은 H-2b 분자에 의해 제한되고 결합한다. 'three-peak' in vivo killing assay에서 동족 표적 세포에 해당하는 두 개의 피크 각각은 면역우성 또는 준우성 펩타이드로 펄스된 비장세포를 나타낼 수 있습니다. 각 펩타이드 세트의 선택은 각 실험의 목적에 따라 다릅니다. 그림 1 및 그림 2를 이러한 변형의 예로 참조하십시오. 이 프로토콜의 나머지 부분에서, T Ag 유래 부위 I 및 IV는 각각 subdominant 및 immunodominant 펩타이드를 나타낼 것입니다.
- 37°C 및 5% CO2에서 1시간 동안 각 펩타이드 1μM로 라벨링된 각 튜브의 함량을 펄스합니다.
- 필요한 경우 각 튜브에 대해 별도의 세포 여과기(70μm 기공이 있음)를 사용하여 덩어리와 파편을 제거합니다.
- 400 x g에서 4 °C에서 5 분 동안 튜브를 스핀 다운합니다. 상층액을 버립니다.
- 펠릿화된 세포를 12mL의 멸균 콜드 PBS에 재현탁시키고 4.4단계를 한 번 더 반복합니다.
참고: FBS는 다음 단계에서 카르복시플루오레세인 숙시니미딜 에스테르(CFSE)와 결합할 수 있으므로 가능한 한 많은 FBS를 제거하는 것이 중요합니다.
5. CFSE로 표적 비장 세포 라벨링
- 펩타이드 펄스 비장세포를 4mL의 멸균 PBS에 재현탁합니다.
- 0.025μM, 0.25μM 및 2μM의 CFSE를 각각 관련 없는 펩타이드, I-부위 및 IV-펄스 비장세포가 포함된 튜브에 추가합니다.
알림: 균일한 CFSE 라벨링을 얻으려면 각 튜브를 45° 각도로 잡고 세포 현탁액보다 약간 높은 쪽에 CFSE를 추가한 다음 즉시 부드러운 와류를 수행합니다. 이렇게 하면 끝에 부드러운 히스토그램이 나타납니다. CFSE 강도의 배치 간 및 연령에 따른 변화는 드문 일이 아닙니다. 따라서 사용할 최적의 농도를 결정하기 전에 차등 CFSE 용량으로 실험해야 할 수도 있습니다.
주의: CFSE는 5μM보다 높은 농도에서 독성이 있습니다.
- 튜브를 37°C 인큐베이터에 15분 동안 넣고 5분에 한 번씩 뒤집습니다.
- 각 튜브에 3mL의 열 불활성화 FBS를 추가하여 CFSE 반응을 중지합니다. 멸균 PBS로 내용물을 보충하십시오.
- 400 x g에서 4 °C에서 5 분 동안 튜브를 스핀 다운합니다. 상층액을 버립니다.
- 펠릿화된 세포를 12mL의 멸균 PBS에 재현탁하고 5.5단계를 반복합니다.
6. 표적 비장 세포 집단의 적절한/동등한 CFSE 라벨링 검사
- 펠릿화된 세포를 PBS 3mL에 재현탁합니다.
- 튜브를 부드럽게 소용돌이치십시오. CFSElow, CFSE중간(int) 및 CFSEhigh 세포 현탁액을 각각 10μL를 200μL의 PBS가 들어 있는 5mL 둥근 바닥 폴리스티렌 형광 활성화 세포 분류(FACS) 튜브로 옮깁니다.
- 488nm 레이저가 장착된 유세포 분석기를 사용하여 세포를 조사합니다. FL-1 채널의 림프구 게이트 내에 속하는 5000개의 이벤트를 획득하기 전에 세포의 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC) 속성을 기반으로 림프구 게이트를 그립니다.
- '상위' CFSE+ 모집단 내에서 추가 히스토그램 게이트를 그려 CFSE낮음,CFSE int 및 CFSE높음 하위 모집단을 식별합니다.
- 3개의 게이트 내에서 동일하거나 거의 동일한 이벤트 번호를 확인합니다. 필요한 경우, 섹션 7에서 표적 비장 세포를 혼합하여 naive 및 primed 마우스에 주입하기 전에 'source' tube의 세포 수를 조정합니다(단계 6.1).
7. Naive 및 T-Ag-primed 수용자에 CFSE 표지 표적 세포 주입
- 소스 튜브를 부드럽게 와류로 만듭니다. CFSE 표지된 3개의 세포 현탁액을 동일한 비율로 새 튜브로 옮깁니다.
- 멸균 PBS로 내용물을 보충하십시오.
- 400 x g에서 4°C에서 5분 동안 튜브를 스핀다운합니다.펠릿화된 세포를 멸균 PBS로 재현탁합니다.
- 혈구계로 트리판 블루의 세포를 계수하여 세포 생존율을 95% 이상 보장합니다.
- 꼬리 정맥을 통해 각 수용체 C57BL/6 마우스에 1 x 107 혼합 타겟 세포/200 μL PBS를 정맥 주사(i.v.)하기 위해 부피를 조정합니다.
참고: 주사 사이에 얼음 위에 세포를 보관하십시오. 각 주사 전에 표적 세포를 부드럽게 혼합하십시오. 각 마우스의 정확한 주사 시간을 기록하면 동물을 안락사해야 하는 시기를 결정할 수 있습니다. 동일한 실험에서 모든 동물에서 생체 내 세포 독성의 지속 시간을 일관되게 유지하는 것이 중요합니다.
8. 데이터 수집
- CFSE 표지된 표적 세포를 주입한 후 2-4시간 후에 자궁경부 탈구로 수용 마우스를 안락사시킵니다.
참고: 생체 내 세포 독성의 지속 기간은 사용된 실험 시스템, 표적 Ags의 면역원성, 비장에서 예상되는 펩타이드 항원 특이적 TCD8의 풍부함, 기타 요인 중에서 용해 기능의 견고성에 따라 달라질 수 있습니다.
- 3.2-3.9 단계와 같이 각 비장을 개별적으로 제거하고 처리합니다.
- 상등액을 버리고 펠릿화된 세포를 3mL의 PBS.
에 재현탁합니다.
참고: 세포형광 분석 전에 4°C 또는 얼음 위에서 비장 조직 및 세포 제제를 취급할 때 각별히 주의하십시오. 이는 생체 외 세포독성이 지속되는 것을 방지하기 위함입니다.
- 처리된 각 비장에서 약 1x107개의 세포를 깨끗한 FACS 튜브로 이동합니다.
- 488nm 레이저가 장착된 유세포 분석기를 사용하여 즉시 세포를 조사합니다. 세포의 FSC 및 SSC 특성을 기반으로 림프구 게이트를 그립니다.
- CFSE- 수혜자의 비장 세포 및 CFSE+ 전이 표적 세포를 식별합니다. 뚜렷한 CFSElow,CFSE int 및 CFSEhigh 표적 세포 집단을 수용하는 추가 게이트를 그립니다.
- FL-1 채널에서 총 2000개의 CFSE로우 이벤트를 획득합니다.
9. 데이터 분석
- 다음 공식을 사용하여 각 동족 타겟 세포 집단의 특정 용해를 계산합니다.
% 특정 세포 독성 = 
여기서 x = T Ag 프라임 마우스의 CFSEint/높은 이벤트 번호, y = T Ag 프라임 마우스의 CFSE낮은 이벤트 번호, a = 나이브 마우스의 CFSEint/높은 이벤트 번호, b = 나이브 마우스의 CFSE낮은 이벤트 번호.
메모: 하나 이상의 동족 타겟 모집단의 특정 용해를 평가하는 'three-peak' 세포 독성 분석에서는 타겟 세포 주파수를 사용하는 것이 적절하지 않습니다. 이것은 단순히 동족 표적 세포 집단의 빈도가 관련 없는 대조군의 비율뿐만 아니라 다른 동족 표적 비장 세포의 비율에 의해서도 영향을 받기 때문입니다. 따라서 CFSE낮은 대조군에 대한 각 동족 표적 세포 집단(CFSEint 또는 CFSE높은 세포)의 용해를 정확하게 계산하기 위해 각 게이트 내의 이벤트 번호를 위의 공식에서 사용해야 합니다.
표 1. 이 프로토콜에 도입된 펩타이드.
(영문)
호
| 단백질 항원 공급원 | 펩타이드 에피토프 | 명칭 | 순서 | MHC I 제한 사항 |
| SV401 대형 T Ag2 | 티에이그206-215 | 사이트 I | 사이냐클 | H-2Db |
| SV40 대형 T Ag | 티 Ag223-231 | 사이트 II/III | CKGVNKEYL | H-2Db |
| SV40 대형 T Ag | 티 Ag404-411 | 사이트 IV | VVYDFLKC | H-2케이b |
| SV40 대형 T Ag | 티 Ag489-497 | 사이트 V | QGINNLDNL | H-2Db |
| HSV-13 당단백질 B | GB498-505* | 재질 보기gB 498-505 | 시팔 | H-2케이b |
| LCMV4 당단백질 | 일반33-41* | 제33-41 | 카빈팻씨 | H-2Db |
| 1유인원 바이러스 40 | | | | |
| 2큰 종양 항원 | | | | |
| 3단순 포진 바이러스 유형 1 | | | |
| 4림프구성 융모수막염 바이러스 | | | |
| *관련 없는 펩타이드로 사용됨 | | | |
