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검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
참고: 사용된 플라스미드 Lifeact-mCherry는 파리 퀴리 연구소의 Guillaume Montagnac 박사의 친절한 선물입니다.
1. 세포와 형질주입
참고: RAW264.7 대식세포는 100mm 플레이트에서 완전한 배지(RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지, 10mM HEPES, 1mM 피루브산 나트륨, 50μM β-메르캅토에탄올, 2mM L-글루타민 및 10% FCS(태아 송아지 혈청))에서 하위 포화 상태로 성장합니다. 이들은 전기천공법(electroporation)에 의해 형광 표지된 단백질을 인코딩하는 플라스미드(plasmid)로 transfection됩니다. 일상적으로 약 5 - 6 x 106개의 세포가 각 transfection 또는 co-transfection에 대해 각각 20 μg 또는 10 μg의 플라스미드로 transfection됩니다. 전기천공법(electroporation) 또는 리포펙션(lipofection)에 기초한 다른 형질주입 방법이 대안적 접근법으로 사용될 수 있다는 점에 유의하십시오.
- 세포 리프터로 세포를 긁어내고 위아래로 여러 번 피펫팅하여 10ml의 배양 배지에 재현탁합니다.
- 셀 현탁액을 300 x g, 스윙 앵글 로터에서 RT에서 5분 동안 원심분리기합니다.
- 10μg/ml의 겐타마이신이 보충된 완전한 배지 10ml를 37°C에서 예열합니다.
- 원심분리 후, 상층액을 버리고 전기천공법 키트에서 3ml의 "세척 완충액 A"에 펠릿을 재현탁합니다.
- 셀 서스펜션을 300 x g, 실온에서 스윙 앵글 로터로 5분 동안 원심분리합니다.
- 그 동안 실온에서 DNA 혼합물을 준비합니다: 120 μl 2x Buffer B, 관심 단백질에 대한 플라스미드 DNA 코딩 20 μg, q.s.p. 240 μl H2O.
- 원심분리 후 상층액 전체를 폐기합니다.
- DNA 혼합물에 세포 펠릿을 재현탁시키고 4mm 전기천공(electroporation) 큐벳으로 옮깁니다.
- RT에서 3분 동안 배양합니다.
- 250V, 900μF에서 전기천공레이트.
- 즉시 겐타마이신이 보충된 예열된(37°C) 완전한 배지에 세포를 재현탁시키고 100mm 접시에 플레이트합니다.
- 형질주입된 세포를 37°C, 5%CO2에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- 다음 날 아침, 전체 배지를 10ml의 무혈청 현미경 배지(페놀 레드가 없는 RPMI 1640, 10mM HEPES, 1mM 피루브산 나트륨, 50μM β-메르캅토에탄올, 2mM L-글루타민)로 교체합니다.
2. 적혈구의 옵소니제이션
참고: 대식세포의 입자 표적 모델로 양 적혈구(SRBC)가 사용됩니다. 일반적으로 35mm 유리 바닥 접시당 약 7 x 106 SRBC가 사용됩니다.
- 100μl의 1x PBS(인산염 완충 식염수)/0.1% BSA(소 혈청 알부민) 및 원심분리기(600 x g, 4분)로 SRBC를 세척합니다.
- 원심분리 후 상층액을 버리고 100μl의 1x PBS/0.1% BSA 및 원심분리기(600 x g, 4분)에 SRBC를 재현탁합니다.
- 원심분리 후 상층액을 버리고 SRBC를 1x PBS/0.1% BSA에 sub-agglutinating 농도의 rabbit IgG anti-SRBCs와 함께 재현탁합니다. 항체가 포함된 용액 500μl/SRBC 5μl를 사용합니다.
메모: 항체의 하위 응집 농도는 네트워크 형성으로 검출된 응집을 유도하지 않은 가장 낮은 농도에 해당합니다. 일반적으로 하위 응집 농도는 8.2μg/ml입니다.
- 적혈구 응집 테스트를 통해 SRBC를 옵소니화하는 데 필요한 IgG 항-SRBC의 농도를 측정합니다. 마이크로플레이트에서 1/50 - 1/25,600 사이의 IgG anti-SRBC(13.1mg/ml 재고)를 연속적으로 희석합니다. 각 웰에 2 x 106 SRBC를 추가합니다. RT에서 몇 시간 동안 어둠 속에서 플레이트를 배양합니다.
- RT에서 30분 동안 천천히 회전하며 배양합니다.
- 위에서 설명한 대로 1x PBS/0.1% BSA에서 2회 세척한 후 예열된 무혈청 현미경 배지(2ml/접시)에 IgG-opsonized SRBC(IgG-SRBC)를 재현탁합니다.
3. 커버 슬립의 폴리 라이신 코팅
- 그 동안 35mm 유리 바닥 접시를 2ml의 0.01% 폴리-L-라이신으로 실온에서 30분 동안 처리합니다.
- 2x PBS 1ml로 접시를 두 번 씻습니다.
4. 유리 바닥 접시에 SRBC의 비공유 고정
- 2mm 유리 바닥 접시당 35ml의 SRBC 현탁액을 붓습니다.
- 500 x g의 스윙 로터가 있는 원심분리기를 2분 동안 35mm 유리 바닥 접시에
올려 놓습니다.
- 상층액을 제거하고 1x PBS/10% BSA 2ml로 한 번 세척합니다.
- 접시당 1x PBS/10% BSA 2ml로 입자를 30분 동안 배양합니다.
- 2x PBS 1ml로 접시를 세 번 씻습니다.
- 1x PBS를 예열된(37°C) 무혈청 현미경 배지 2ml로 교체합니다.
5. TIRFM에 의해 시각화된 식세포작용
- 현미경
메모: TIRFM은 오일 이멀젼 대물렌즈(N 100X, NA1.49)가 장착된 현미경, CO2가 있는 가열 챔버, 1.5X 렌즈와 결합된 두 개의 단일 광자 검출 카메라 EMCCD(Electron Multiplying Charge Coupled Device)를 사용하여 수행되었습니다.
- TIRF 현미경 세션 전날, 37ºC에서 가열 챔버를 켜서 현미경 스테이지를 균일하게 가열할 수 있습니다.
- 임계각 측정
메모: ImageJ Color Profiler 소프트웨어는 TIRF 이미지 스트림을 처리하는 데 사용됩니다.
- 무혈청 현미경 매체가 있는 opsonized SRBC가 들어 있는 35mm 유리 바닥 접시를 현미경 아래에 놓습니다.
- 세포를 긁어내고 접시에 넣기 전에(100 - 500 μl) 배지에 다시 현탁시킵니다.
- "Live Acquisition" 소프트웨어를 사용하여 현미경을 제어하고 491nm 및/또는 561nm 레이저로 여기(excitation)를 수행하여 형광 표지된 단백질을 발현하는 세포를 식별할
수 있습니다.
- 형광 표지된 단백질을 발현하는 세포를 식별합니다.
- 필드 중앙에 배치하고 0º에서 최대 5º까지 다양한 각도로 0.01º씩 증가하여 하나의 여기 파장에서 500개의 이미지를 획득합니다(그림 1A). 각도는 현미경 시스템에 의해 자동으로 변경됩니다.
- 입사광이 유리/매체 계면에서 완전히 반사되도록 하는 임계각을 결정하고 소멸파를 생성합니다. ImageJ Color Profiler 소프트웨어를 사용하여 "파일", "열기"를 클릭하여 이미지 시퀀스를 열고 파일을 선택합니다.
- 사각형 도구를 사용하여 형광이 균일한 셀에서 관심 영역(ROI)을 선택합니다(그림 1B 노란색 1).
- "Z축 프로파일"은 "이미지" 탭, 드롭다운 메뉴의 "스택" 및 "Z축 프로파일 플롯"을 클릭하여 x축의 각도 함수와 함께 ROI에서 측정된 형광 강도를 플롯합니다(그림 1B, 빨간색 2).
참고: 임계각(critical angle)은 형광이 급격히 감소하기 전에 최대 형광으로 이어지는 각도입니다.
- 현미경 세션 동안 임계각보다 높은 x축의 각도 값을 사용하여 예 2.00과 같은 TIRF 신호를 얻습니다(그림 1C).
- 인수
- Live Acquisition 소프트웨어를 사용하여 "Protocol Editor" 모듈로 수집 매개변수를 설정합니다(그림 2A).
- TIRF 영역의 관심 단백질로부터 형광 신호를 획득하기 위해 "다중 채널" 획득으로 구성된 "루프"가 있는 프로토콜을 생성합니다. TIRF 각도(예: 2.00), 노출 시간(예: 50msec) 및 레이저 강도(예: 50%)를 입력합니다(그림 2B 1).
- TIRF 영역보다 3μm 높은 대물렌즈의 "Z 이동"을 도입하여 "Multi Channels" 도구로 에피형광에서 신호 획득을 얻습니다. 임계각(예: 1.00), 노출 시간(50msec) 및 레이저 강도(50%) 미만의 각도를 입력합니다(그림 2B, 2 및 3).
- 다음으로 아래 3μm 아래의 대물렌즈의 "z 이동"을 추가하여 TIRF 영역으로 반환합니다(그림 3B 4). 밝은 빛 LED(발광 다이오드)에 셀의 "스냅샷"을 추가합니다(그림 2B 5).
- 입자 주위의 원형질막을 확장하여 SRBC의 식세포작용을 시작하는 중간 수준의 형광 표지 단백질 발현을 가진 관심 세포를 찾습니다.
- 필드 중앙에 놓으십시오.
- 500 - 1,000 프레임의 스트리밍 획득을 시작합니다. "loop count" 탭에서 "750 frames"를 입력합니다(그림 2B 1).
메모: ImageJ Color Profiler 소프트웨어는 TIRF 이미지 스트림을 처리하는 데 사용됩니다.
- "파일", "열기"를 클릭하고 파일을 선택하여 Image J 소프트웨어에서 시퀀스 이미지를 엽니다.
- "이미지"탭, "하이퍼 스택"드롭 다운 메뉴 및 "스택에 하이퍼 스택"기능을 클릭하여 채널을 분리합니다. 나타난 창을 완료하십시오 : 주문 : xyctz; 채널 (c) : 채널 수 (예 : 두 개의 형광 색소가있는 경우 "2"). 슬라이스 (z): z축의 슬라이스 수(예: z축에 이동이 없는 경우 "1"). 프레임 (t) : 채널 수에 따라 나뉘어 진 이미지 수; 디스플레이 모드: Grayscale.
메모: 두 개의 서로 다른 채널에 해당하는 두 개의 개별 이미지 시퀀스가 생성됩니다.
