TIRF 현미경 기반 식체 형성 및 폐쇄 시각화

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

참고: 사용된 플라스미드 Lifeact-mCherry는 파리 퀴리 연구소의 Guillaume Montagnac 박사의 친절한 선물입니다.

1. 세포와 형질주입

참고: RAW264.7 대식세포는 100mm 플레이트에서 완전한 배지(RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지, 10mM HEPES, 1mM 피루브산 나트륨, 50μM β-메르캅토에탄올, 2mM L-글루타민 및 10% FCS(태아 송아지 혈청))에서 하위 포화 상태로 성장합니다. 이들은 전기천공법(electroporation)에 의해 형광 표지된 단백질을 인코딩하는 플라스미드(plasmid)로 transfection됩니다. 일상적으로 약 5 - 6 x 10⁶개의 세포가 각 transfection 또는 co-transfection에 대해 각각 20 μg 또는 10 μg의 플라스미드로 transfection됩니다. 전기천공법(electroporation) 또는 리포펙션(lipofection)에 기초한 다른 형질주입 방법이 대안적 접근법으로 사용될 수 있다는 점에 유의하십시오.

1. 세포 리프터로 세포를 긁어내고 위아래로 여러 번 피펫팅하여 10ml의 배양 배지에 재현탁합니다.
2. 셀 현탁액을 300 x g, 스윙 앵글 로터에서 RT에서 5분 동안 원심분리기합니다.
3. 10μg/ml의 겐타마이신이 보충된 완전한 배지 10ml를 37°C에서 예열합니다.
4. 원심분리 후, 상층액을 버리고 전기천공법 키트에서 3ml의 "세척 완충액 A"에 펠릿을 재현탁합니다.
5. 셀 서스펜션을 300 x g, 실온에서 스윙 앵글 로터로 5분 동안 원심분리합니다.
6. 그 동안 실온에서 DNA 혼합물을 준비합니다: 120 μl 2x Buffer B, 관심 단백질에 대한 플라스미드 DNA 코딩 20 μg, q.s.p. 240 μl H₂O.
7. 원심분리 후 상층액 전체를 폐기합니다.
8. DNA 혼합물에 세포 펠릿을 재현탁시키고 4mm 전기천공(electroporation) 큐벳으로 옮깁니다.
9. RT에서 3분 동안 배양합니다.
10. 250V, 900μF에서 전기천공레이트.
11. 즉시 겐타마이신이 보충된 예열된(37°C) 완전한 배지에 세포를 재현탁시키고 100mm 접시에 플레이트합니다.
12. 형질주입된 세포를 37°C, 5%_CO2에서 하룻밤 동안 배양합니다.
13. 다음 날 아침, 전체 배지를 10ml의 무혈청 현미경 배지(페놀 레드가 없는 RPMI 1640, 10mM HEPES, 1mM 피루브산 나트륨, 50μM β-메르캅토에탄올, 2mM L-글루타민)로 교체합니다.

2. 적혈구의 옵소니제이션

참고: 대식세포의 입자 표적 모델로 양 적혈구(SRBC)가 사용됩니다. 일반적으로 35mm 유리 바닥 접시당 약 7 x 10⁶ SRBC가 사용됩니다.

1. 100μl의 1x PBS(인산염 완충 식염수)/0.1% BSA(소 혈청 알부민) 및 원심분리기(600 x g, 4분)로 SRBC를 세척합니다.
2. 원심분리 후 상층액을 버리고 100μl의 1x PBS/0.1% BSA 및 원심분리기(600 x g, 4분)에 SRBC를 재현탁합니다.
3. 원심분리 후 상층액을 버리고 SRBC를 1x PBS/0.1% BSA에 sub-agglutinating 농도의 rabbit IgG anti-SRBCs와 함께 재현탁합니다. 항체가 포함된 용액 500μl/SRBC 5μl를 사용합니다.
   메모: 항체의 하위 응집 농도는 네트워크 형성으로 검출된 응집을 유도하지 않은 가장 낮은 농도에 해당합니다. 일반적으로 하위 응집 농도는 8.2μg/ml입니다.
   1. 적혈구 응집 테스트를 통해 SRBC를 옵소니화하는 데 필요한 IgG 항-SRBC의 농도를 측정합니다. 마이크로플레이트에서 1/50 - 1/25,600 사이의 IgG anti-SRBC(13.1mg/ml 재고)를 연속적으로 희석합니다. 각 웰에 2 x 10⁶ SRBC를 추가합니다. RT에서 몇 시간 동안 어둠 속에서 플레이트를 배양합니다.
4. RT에서 30분 동안 천천히 회전하며 배양합니다.
5. 위에서 설명한 대로 1x PBS/0.1% BSA에서 2회 세척한 후 예열된 무혈청 현미경 배지(2ml/접시)에 IgG-opsonized SRBC(IgG-SRBC)를 재현탁합니다.

3. 커버 슬립의 폴리 라이신 코팅

1. 그 동안 35mm 유리 바닥 접시를 2ml의 0.01% 폴리-L-라이신으로 실온에서 30분 동안 처리합니다.
2. 2x PBS 1ml로 접시를 두 번 씻습니다.

4. 유리 바닥 접시에 SRBC의 비공유 고정

1. 2mm 유리 바닥 접시당 35ml의 SRBC 현탁액을 붓습니다.
2. 500 x g의 스윙 로터가 있는 원심분리기를 2분 동안 35mm 유리 바닥 접시에
올려 놓습니다.
3. 상층액을 제거하고 1x PBS/10% BSA 2ml로 한 번 세척합니다.
4. 접시당 1x PBS/10% BSA 2ml로 입자를 30분 동안 배양합니다.
5. 2x PBS 1ml로 접시를 세 번 씻습니다.
6. 1x PBS를 예열된(37°C) 무혈청 현미경 배지 2ml로 교체합니다.

5. TIRFM에 의해 시각화된 식세포작용

1. 현미경
   메모: TIRFM은 오일 이멀젼 대물렌즈(N 100X, NA1.49)가 장착된 현미경, CO₂가 있는 가열 챔버, 1.5X 렌즈와 결합된 두 개의 단일 광자 검출 카메라 EMCCD(Electron Multiplying Charge Coupled Device)를 사용하여 수행되었습니다.
   1. TIRF 현미경 세션 전날, 37ºC에서 가열 챔버를 켜서 현미경 스테이지를 균일하게 가열할 수 있습니다.
2. 임계각 측정
   메모: ImageJ Color Profiler 소프트웨어는 TIRF 이미지 스트림을 처리하는 데 사용됩니다.
   1. 무혈청 현미경 매체가 있는 opsonized SRBC가 들어 있는 35mm 유리 바닥 접시를 현미경 아래에 놓습니다.
   2. 세포를 긁어내고 접시에 넣기 전에(100 - 500 μl) 배지에 다시 현탁시킵니다.
   3. "Live Acquisition" 소프트웨어를 사용하여 현미경을 제어하고 491nm 및/또는 561nm 레이저로 여기(excitation)를 수행하여 형광 표지된 단백질을 발현하는 세포를 식별할
   수 있습니다.
   4. 형광 표지된 단백질을 발현하는 세포를 식별합니다.
   5. 필드 중앙에 배치하고 0º에서 최대 5º까지 다양한 각도로 0.01º씩 증가하여 하나의 여기 파장에서 500개의 이미지를 획득합니다(그림 1A). 각도는 현미경 시스템에 의해 자동으로 변경됩니다.
   6. 입사광이 유리/매체 계면에서 완전히 반사되도록 하는 임계각을 결정하고 소멸파를 생성합니다. ImageJ Color Profiler 소프트웨어를 사용하여 "파일", "열기"를 클릭하여 이미지 시퀀스를 열고 파일을 선택합니다.
   7. 사각형 도구를 사용하여 형광이 균일한 셀에서 관심 영역(ROI)을 선택합니다(그림 1B 노란색 1).
   8. "Z축 프로파일"은 "이미지" 탭, 드롭다운 메뉴의 "스택" 및 "Z축 프로파일 플롯"을 클릭하여 x축의 각도 함수와 함께 ROI에서 측정된 형광 강도를 플롯합니다(그림 1B, 빨간색 2).
      참고: 임계각(critical angle)은 형광이 급격히 감소하기 전에 최대 형광으로 이어지는 각도입니다.
   9. 현미경 세션 동안 임계각보다 높은 x축의 각도 값을 사용하여 예 2.00과 같은 TIRF 신호를 얻습니다(그림 1C).
3. 인수
   1. Live Acquisition 소프트웨어를 사용하여 "Protocol Editor" 모듈로 수집 매개변수를 설정합니다(그림 2A).
      1. TIRF 영역의 관심 단백질로부터 형광 신호를 획득하기 위해 "다중 채널" 획득으로 구성된 "루프"가 있는 프로토콜을 생성합니다. TIRF 각도(예: 2.00), 노출 시간(예: 50msec) 및 레이저 강도(예: 50%)를 입력합니다(그림 2B 1).
      2. TIRF 영역보다 3μm 높은 대물렌즈의 "Z 이동"을 도입하여 "Multi Channels" 도구로 에피형광에서 신호 획득을 얻습니다. 임계각(예: 1.00), 노출 시간(50msec) 및 레이저 강도(50%) 미만의 각도를 입력합니다(그림 2B, 2 및 3).
      3. 다음으로 아래 3μm 아래의 대물렌즈의 "z 이동"을 추가하여 TIRF 영역으로 반환합니다(그림 3B 4). 밝은 빛 LED(발광 다이오드)에 셀의 "스냅샷"을 추가합니다(그림 2B 5).
   2. 입자 주위의 원형질막을 확장하여 SRBC의 식세포작용을 시작하는 중간 수준의 형광 표지 단백질 발현을 가진 관심 세포를 찾습니다.
   3. 필드 중앙에 놓으십시오.
   4. 500 - 1,000 프레임의 스트리밍 획득을 시작합니다. "loop count" 탭에서 "750 frames"를 입력합니다(그림 2B 1).
      메모: ImageJ Color Profiler 소프트웨어는 TIRF 이미지 스트림을 처리하는 데 사용됩니다.
   5. "파일", "열기"를 클릭하고 파일을 선택하여 Image J 소프트웨어에서 시퀀스 이미지를 엽니다.
   6. "이미지"탭, "하이퍼 스택"드롭 다운 메뉴 및 "스택에 하이퍼 스택"기능을 클릭하여 채널을 분리합니다. 나타난 창을 완료하십시오 : 주문 : xyctz; 채널 (c) : 채널 수 (예 : 두 개의 형광 색소가있는 경우 "2"). 슬라이스 (z): z축의 슬라이스 수(예: z축에 이동이 없는 경우 "1"). 프레임 (t) : 채널 수에 따라 나뉘어 진 이미지 수; 디스플레이 모드: Grayscale.
      메모: 두 개의 서로 다른 채널에 해당하는 두 개의 개별 이미지 시퀀스가 생성됩니다.

그림 1. TIRFM에 의해 분석된 "Phagosome Closure Assay"의 개략도. phagosome closure assay는 하나 또는 두 개의 형광 표지 단백질을 일시적으로 발현하는 대식세포를 사용하여 수행됩니다. 대식세포는 폴리-라이신 코팅된 커버슬립에 비공유 고정되는 IgG-opsonized SRBC에 증착됩니다. 이미지는 식세포 폐쇄 부위를 감지하기 위해 TIRF 모드로 기록되고 식세포 컵의 기저를 감지하기 위해 상형광 모드로 기록됩니다.

그림 2: TIRFM에 대한 임계각 측정. (A) "Live acquisition"을 사용하여 형광 표지된 단백질을 발현하는 세포를 필드의 중앙(빨간색으로 표시된 영역 1)에 배치합니다. TIRF 스택 옵션을 사용하면 0°에서 최대 5°까지 다양한 각도로 0.01°(빨간색의 영역 2)씩 증가하여 하나의 여기 파장에서 이미지를 획득할 수 있습니다. (B) 이미지 시퀀스는 ImageJ Color Profiler 소프트웨어를 사용하여 열리고 관심 영역(ROI)의 평균 형광 강도는 "Stacks" 및 "PlotZ 축 프로파일"(빨간색 영역 1)을 사용하여 x축의 각도 함수로 플롯됩니다. (C) 플롯에서 형광 피크의 x 위치는 임계각: 1.98°(검은색 점선)에 해당합니다. 이 각도 이후의 모든 값을 사용할 수 있습니다. 예를 들어 2.00°를 선택할 수 있습니다(빨간색 선).

그림 3. Live Acquisition Module을 사용한 워크플로우 프로세스: "Protocol Editor". (A) "Protocol Editor" 창에서 워크플로우 캔버스가 생성됩니다. (B) 이 프로토콜은 사용자가 결정한 횟수만큼 현미경이 반복하는 동작의 "루프"로 구성됩니다. 예: 750 (1). 하나의 루프 포함: TIRF 모드에서 관심 형광 단백질의 레이저 여기를 사용한 "다중 채널" 획득. 예: 레이저 491nm 강도 50% -TIRF 각도 2.00(2); 대물렌즈 3 μm의 "Z 이동"(3); 에피형광 모드에서 "다중 채널" 획득 (4); 대물렌즈를 TIRF 영역(5)으로 다시 "Z"이동"하고 투과광에서 "스냅샷"(6)