백혈구 증식에 대한 단핵구의 면역조절 효과를 평가하기 위한 체외 분석

초록

출처: Hsu, P., et al. 인간 중간엽 줄기세포(MSC)의 면역조절 특성 평가. J. Vis. 특급 (2015)

이 비디오는 중간엽 줄기세포(MSC)가 effector T 세포 증식에 미치는 면역조절 영향을 조사하기 위한 시험관 내 분석을 보여줍니다. 이 분석에는 MSC와 PBMC를 공동 배양하여 단핵구 집단이 면역조절 표현형을 획득하도록 유도하여 인터루킨-10(IL-10)의 분비를 유도하는 것이 포함됩니다. 활성화된 CD4⁺ T 세포를 배양한 후, 유도된 단핵구는 T 세포 증식을 효과적으로 억제합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 밀도 구배 분리

1. 25ml 피펫으로 50ml 튜브에 25ml의 헤파린화된 전혈을 추가합니다.
   1. 25ml의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 희석합니다.
2. 15ml의 Ficoll-Paque 밀도 구배를 새로운 50ml 튜브에 추가하고, 튜브를 기울이면서 밀도 구배 위에 희석된 세포 현탁액 25ml를 매우 천천히 조심스럽게 첨가하여 전체 혈액이 밀도 구배와 혼합되지 않도록, 즉 혈액 밀도 구배 계면의 방해가 없도록 합니다.
20°
3. C에서 브레이크 없이 온도 제어가 가능한 스윙 버켓 로터에서 30-40분 동안 400×g에서 1.2단계의 서스펜션을 원심분리
   메모: 원심분리 후에 세 개의 뚜렷한 층이 분명해야 합니다: 상부 층은 플라즈마입니다. 하단 투명 층은 Ficoll-Paque 밀도 구배입니다. 그리고 얇은 중간 세포층은 PBMC입니다.
4. 파스퇴르 피펫으로 흡입하여 상층을 흡인하고 폐기하되, 단....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Ficoll-Paque 플러스	GE 헬스케어	71-7167-00 AG	말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 분리를 위한 밀도 확대
생생한 CFDA-SE 세포 추적 키트(CFSE)	생명 기술	V12883	세포 분열 검출을 위한 세포 라벨
Dynabeads 휴먼 T-액티베이터 CD3/28	생명 기술	111.32디	인간 T 림프구의 활성화(예: CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 등)
autoMACS™ 분리기	밀테니 바이오텍	autoMACS™ 분리기	자기 기반 셀 분리기
autoMACS® 컬럼	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-021-101	분리 컬럼
CD14 마이크로비즈, 인간	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-050-201	PBMC에서 CD14+ 인간 단핵구 및 대식세포의 양성 선택
CD4 마이크로비즈, 인간	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-045-101	PBMC에서 CD4+ human T lymphocites의 양성 선택
RPMI 1640 미디엄	생명 기술	11875	인간 PBMC/백혈구 배양 배지
DMEM, 저포도당, 피루브산	생명 기술	11885	인간 중간엽 줄기세포(MSC) 배양 배지
L-글루타민	생명 기술	제25030-081	MSC 완전 배지를 위한 보충제
페니실린/스트렙토마이신	생명 기술	제15070-063	PBMC/백혈구 및 MSC 완전 배지에 대한 보충제
소 태아 혈청(FBS)	1) Hyclone, MSC 배양용, 2) Life Technologies, 기타 모든 세포(즉, PBMC, 특정 백혈구 집단)	1) SH30070.03M 2) 10091-148	MSC in vitro 배양 지원을 위한 사전 테스트 로트
24웰 세포 배양 플레이트	코 닝	COR3524	공동 배양 플레이트
50 mL 원심분리기 튜브	코 닝	430291	Ficoll-Paque PLUS에 의한 전혈에서 PBMC 분리
15 mL 원심분리기 튜브	코 닝	430766	Labeled 및 Unlabeled cell fractions의 수집
둥근 바닥 튜브	BD 팔콘	352008	유세포 분석을 위한 세포 수집

년 년 호 호