백혈구 증식에 대한 단핵구의 면역조절 효과를 평가하기 위한 체외 분석

초록

출처: Hsu, P., et al. 인간 중간엽 줄기세포(MSC)의 면역조절 특성 평가. J. Vis. 특급 (2015)

이 비디오는 중간엽 줄기세포(MSC)가 effector T 세포 증식에 미치는 면역조절 영향을 조사하기 위한 시험관 내 분석을 보여줍니다. 이 분석에는 MSC와 PBMC를 공동 배양하여 단핵구 집단이 면역조절 표현형을 획득하도록 유도하여 인터루킨-10(IL-10)의 분비를 유도하는 것이 포함됩니다. 활성화된 CD4⁺ T 세포를 배양한 후, 유도된 단핵구는 T 세포 증식을 효과적으로 억제합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 밀도 구배 분리

1. 25ml 피펫으로 50ml 튜브에 25ml의 헤파린화된 전혈을 추가합니다.
   1. 25ml의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 희석합니다.
2. 15ml의 Ficoll-Paque 밀도 구배를 새로운 50ml 튜브에 추가하고, 튜브를 기울이면서 밀도 구배 위에 희석된 세포 현탁액 25ml를 매우 천천히 조심스럽게 첨가하여 전체 혈액이 밀도 구배와 혼합되지 않도록, 즉 혈액 밀도 구배 계면의 방해가 없도록 합니다.
20°
3. C에서 브레이크 없이 온도 제어가 가능한 스윙 버켓 로터에서 30-40분 동안 400×g에서 1.2단계의 서스펜션을 원심분리
   메모: 원심분리 후에 세 개의 뚜렷한 층이 분명해야 합니다: 상부 층은 플라즈마입니다. 하단 투명 층은 Ficoll-Paque 밀도 구배입니다. 그리고 얇은 중간 세포층은 PBMC입니다.
4. 파스퇴르 피펫으로 흡입하여 상층을 흡인하고 폐기하되, 단핵 세포(즉, 림프구, 단핵구, 혈소판)의 간층을 방해하지 않도록 주의합니다.
5. 10ml 피펫을 사용하여 이 단핵 세포층을 새 50ml 원심분리 튜브에 조심스럽게 수집합니다.
6. 튜브에 PBS 20ml를 채우고 잘 섞은 다음 300×g에서 20°C에서 10분 동안 원심분리합니다.원심분리 후 상층액을 완전히 제거합니다.
7. 세포 펠릿을 PBS 20ml에 재현탁시키고 200 × g에서 20 °C에서 10-15 분 동안 원심 분리합니다.원심분리 후 상등액을 완전히 제거합니다.
   메모: 이 단계는 PBMC 내에서 원치 않는 혈소판을 제거합니다. 혈소판을 완전히 제거하기 위해 이 단계를 반복할 수 있습니다.
8. 특정 집단을 선택하지 않는 경우, 다음 단계로 진행하기 전에 세포 계수를 수행하여^10,7 PBMC당 배지 1ml를 현탁시킨 후 배양을 위해 백혈구 완전 배지(10% 소 태아 혈청(FBS), 1% L-글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신)에 세포 펠렛을 재현탁합니다.

2. 백혈구 집단의 자기 라벨링

1. PBMC 원심분리기, 300×g에서 10분 동안 현탁액, 상층액을 완전히 흡인합니다.
2. 총 세포 10⁷개당 PBS 80μl에 세포 펠렛을 재현탁합니다.
3. 총 10⁷개의 세포당 20μl의 지정된 마그네틱 비드(즉, 단핵구 분리를 위한 CD14 마그네틱 비드, T 림프구 분리를 위한 CD4 마그네틱 비드)를 추가합니다.
4. 잘 섞어 냉장고에서 2-8 °C에서 15 분 동안 배양합니다.
5. 세척하기 위하여 10⁷개의 세포 당 PBS의 1-2 ml를 추가하고, 300 × g에 10 분 동안 원심분리하십시오.
6. 상층액을 완전히 흡인하고 500μl의 PBS에 최대 10개의⁸개 세포를 재현탁합니다.

3. 백혈구 하위 집단의 자기 선택

참고: 다양한 마그네틱 비드 분리기 및 컬럼을 사용하여 여러 제조업체의 세포 표면 마커로 특정 백혈구 집단을 분리할 수 있습니다. 격리는 하나 또는 몇 개의 양성 마커에 기초한 양성 선택 또는 원치 않는 개체군의 고갈 후 음성 선택에 의해 이루어질 수 있습니다. 하나의 마커(즉, T 보조 림프구의 경우 CD4 또는 단핵구의 경우 CD14)를 사용하여 양성 선택을 수행하는 일반적인 접근 방식은 다음과 같습니다.

1. 제조업체의 지침에 따라 분리 컬럼을 포함한 자기 분리기를 준비하고 프라이밍합니다.
2. 라벨링된 PBMC 샘플이 들어 있는 튜브를 적용합니다.제조업체의 지침에 따라 양성으로 라벨링된 세포 분획과 라벨링되지 않은 세포 분획을 수집하기 위해 두 개의 15ml 원심분리 튜브를 제공합니다.
3. 세포 수를 계수하고 10⁷ 세포당 1ml의 배지를 사용하여 양성으로 선택된 백혈구(즉, CD4⁺ T 림프구 또는 CD14⁺ 세포)를 백혈구 완전 배지에 재현탁합니다.

4. 증식 평가를 위한 백혈구의 Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) 염색

참고: CFSE는 생체 내 및 체외 연구 모두에서 면역학 조사에 널리 사용되었습니다. 당사의 프로토콜은 MSC/PBMC(또는 기타 백혈구) 상호 작용의 체외 연구에 최적화되었습니다. CFSE in vitro 라벨링 수행과 관련된 일반적인 단계는 유사하지만 프로토콜의 특정 용량과 시기에 차이가 있을 수 있습니다. 이는 CFSE 형광 신호의 강도에 영향을 미칠 수 있는 여러 요인, 즉 사용된 특정 세포 유형, 사용된 세포 수 때문일 수 있습니다.

1. PBS의 CFSE 원액(10mM)을 원하는 작업 농도인 10μM(CFSE 작업 용액)로 희석합니다. CFSE 작업 용액으로 라벨링할 10개의⁷개 세포(즉, PBMC 또는 T 세포)를 준비합니다.
2. 300 × g에서 10분 동안 원심분리기를 하여 세포 펠릿을 얻고 상층액을 흡입합니다.
3. 예열된(37°C) CFSE 작용 용액 1ml에 세포를 부드럽게 재현탁시키고 37°C에서 10분 동안 세포를 배양합니다.
4. 과도한 CFSE를 씻어내려면 10% FBS를 함유한 예냉각된(4°C) RPMI 배지 10배(부피 기준)로 셀 현탁액을 희석합니다. 300 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 침전하고 상층액을 버립니다. 이런 식으로 세포 펠릿을 두 번 더 씻으십시오.
5. 원심분리로 세포를 재펠릿화하고 세포 수를 계산합니다. 10⁷ 세포(PBMC 또는 T 세포)를 1ml의 신선하고 예열된 백혈구 완전 배지에 재현탁합니다.

5. Effector Suppression Assay Magnetic Bead-selected, MSC-induced Immunomodulatory Leukocytes on Activated CFSE labeled Effector CD4 ⁺ T cells (활성 CFSE 표지 효과기 CD4 + T 세포에 대한 이펙터 억제 분석 마그네틱 비드 선택, MSC 유도 면역 조절 백혈

구

1. 37°C 인큐베이터에서 O/N을 부착하기 위해 6웰 플레이트(MSC 밀도: 25,000 cells/cm²)의 MSC 완전 배지 3ml에 있는 250,000개의 세포에 MSC를 파종하여 줄기세포가 80% 합류점에 도달할 수 있도록 합니다.하위집단 선택을 위해 충분한 MSC 공동 배양 PBMC를 보장하기 위해 최소 3개의 6웰 플레이트가 필요합니다.
2. 배지를 흡인하고 1단계에 따라 분리된 PBMC를 2.5 x 10⁶ cells/well(세포 밀도: 250,000 leukocytes/cm²)의 6-well 플레이트에 3ml의 백혈구 완전 배지와 함께 추가합니다. 37 ° C 인큐베이터에서 48-72 시간 동안 공동 배양.
3. 섹션 2-3.
   에 따른 MSC 유도 면역조절 백혈구(즉, CD14⁺ 세포)의 마그네틱 비드 선택 특정 집단 메모: 이 시점에서 유세포 분석을 위한 세포 내 사이토카인 염색을 수행하여 백혈구 사이토카인 발현 프로파일의 변화, 즉 MSC에 의해 조절된 인터루킨-10-AS의 발현을 평가할 수 있습니다.
4. 백혈구 완전 배지 1ml(T 세포 밀도: 250,000 cells/cm²)의 24웰 플레이트에 섹션 2-4에 따라 생성된 CFSE 표지 동종 CD4⁺ T 세포를 다양한 비율, 즉 1:10, 1:5, 1:2 및 1:1(세포 대 세포) 비율로 비드 선정 MSC 유도 백혈구에 추가합니다.
5. CD4⁺ T 세포를 자극하기 위해 α-CD3/28 접합 마이크로비드를 첨가하여 1:1의 비드 대 세포 비율을 얻습니다.
6. 음성 대조군의 경우, 24웰 플레이트(T 세포 밀도: 250,000 cells/cm²)에 1ml 백혈구 완전 배지만 사용하여 500,000 CD4⁺ T cells/well을 플레이트화합니다. 양성 대조군의 경우, 동일한 수의 CD4⁺ T cell/well을 도금하는 것 외에도 α-CD3/28 conjugated microbeads를 추가하여 1:1의 bead-to-cell ratio를 얻습니다.
7. 공동 배양 3일차에 플루오레세인에 적합한 488nm 여기 및 방출 필터를 사용한 유세포 분석을 통해 CFSE 표지 CD4⁺ T 세포(둥근 바닥 튜브에 배치)의 증식을 평가합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Ficoll-Paque 플러스	GE 헬스케어	71-7167-00 AG	말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 분리를 위한 밀도 확대
생생한 CFDA-SE 세포 추적 키트(CFSE)	생명 기술	V12883	세포 분열 검출을 위한 세포 라벨
Dynabeads 휴먼 T-액티베이터 CD3/28	생명 기술	111.32디	인간 T 림프구의 활성화(예: CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 등)
autoMACS™ 분리기	밀테니 바이오텍	autoMACS™ 분리기	자기 기반 셀 분리기
autoMACS® 컬럼	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-021-101	분리 컬럼
CD14 마이크로비즈, 인간	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-050-201	PBMC에서 CD14+ 인간 단핵구 및 대식세포의 양성 선택
CD4 마이크로비즈, 인간	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-045-101	PBMC에서 CD4+ human T lymphocites의 양성 선택
RPMI 1640 미디엄	생명 기술	11875	인간 PBMC/백혈구 배양 배지
DMEM, 저포도당, 피루브산	생명 기술	11885	인간 중간엽 줄기세포(MSC) 배양 배지
L-글루타민	생명 기술	제25030-081	MSC 완전 배지를 위한 보충제
페니실린/스트렙토마이신	생명 기술	제15070-063	PBMC/백혈구 및 MSC 완전 배지에 대한 보충제
소 태아 혈청(FBS)	1) Hyclone, MSC 배양용, 2) Life Technologies, 기타 모든 세포(즉, PBMC, 특정 백혈구 집단)	1) SH30070.03M 2) 10091-148	MSC in vitro 배양 지원을 위한 사전 테스트 로트
24웰 세포 배양 플레이트	코 닝	COR3524	공동 배양 플레이트
50 mL 원심분리기 튜브	코 닝	430291	Ficoll-Paque PLUS에 의한 전혈에서 PBMC 분리
15 mL 원심분리기 튜브	코 닝	430766	Labeled 및 Unlabeled cell fractions의 수집
둥근 바닥 튜브	BD 팔콘	352008	유세포 분석을 위한 세포 수집

년 년 호 호