백혈구 모집에 대한 기질 세포의 효과에 대한 체외 흐름 조사

초록

출처: Munir, H. et al., Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow. J. Vis. 특급.(2015년)

이 비디오는 백혈구 동원에 대한 기질 세포의 영향을 조사하는 방법을 보여줍니다. 평행 플레이트 유동 챔버 모델에서, 전염증성 사이토카인은 내피 세포에 의한 접착 수용체의 발현을 유도하여 호중구 모집 및 이동을 촉진합니다. 기질 세포와 내피 세포 사이의 누화는 내피 세포로의 호중구 모집을 감소시킵니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 일차 인간 내피 세포와 중간엽 줄기 세포의 분리 및 배양

1. 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)의 분리 및 배양:
   1. 탯줄을 종이 타월로 쟁반에 놓고 70% 에탄올을 뿌립니다. 조직 배양 후드에 넣습니다. 정맥을 확인하고 양쪽 끝에서 캐뉼레이트를 합니다. 캐뉼러 끝 부분에 케이블 타이를 놓아 고정합니다.
   2. 주사기를 사용하여 인산염 완충 식염수(PBS)로 정맥혈을 씻어냅니다. 주사기에 공기를 채우고 정맥을 통과시켜 잔류 PBS를 제거하고 폐기합니다.
   3. 10mg/ml 콜라겐분해효소 Ia 형을 해동하고 PBS(칼슘 및 염화마그네슘 포함)에서 1:10을 최종 농도 1mg/ml로 희석합니다. 두 캐뉼라가 채워질 때까지 콜라겐분해효소 용액을 정맥에 통과시킵니다. 양쪽 끝의 캐뉼러에 클램프를 닫습니다.
   4. 트레이를 티슈로 덮고 70% 에탄올을 뿌립니다. 코드를 20°C에서 37분 동안 인큐베이터에 넣고 이산화탄소(CO₅
   )를 넣습니다.
   5. 인큐베이터에서 코드를 꺼내고 케이블 타이를 조입니다. 코드를 1분 동안 부드럽게 마사지합니다. 10ml PBS로 세포 현탁액을 세척하고 50ml 원심분리 튜브에 수집합니다.
   6. 주사기에 공기를 채우고 정맥을 통과시켜 잔류 PBS를 두 번 제거한 후 1.1.5단계에서 사용한 50ml 원심분리 튜브에 PBS를 수집합니다. 실온(RT)에서 5분 동안 400 x g에서 원심분리기.
   7. 상층액을 흡인하고 펠렛을 1ml 완전 내피 세포(EC) 배지에 재현탁합니다. EC 배지는 35μg/ml 황산겐타마이신, 10ng/ml 인간 표피 성장 인자, 1μg/ml 하이드로코르티손, 2.5μg/ml 암포테리신 B 및 20% 태아 송아지 혈청이 보충된 M199로 구성됩니다.
   8. 4ml의 EC 배지와 EC 현탁액을 25cm² 플라스크에 추가합니다. 다음 날에 매체를 변경하고 그 이후에는 2일마다 매체를 변경합니다.
   9. EC는 조약돌과 같은 형태를 나타냅니다(그림 1Ai). 접착 분석의 경우, EC는 일반적으로 100% 합류점에 도달할 때 파종됩니다(섹션 1.4 참조).
2. 인간 탯줄에서 Wharton's jelly mesenchymal stem cells(WJMSC) 분리:
   1. Wharton's jelly-derived MSC(WJMSC)를 새로운 탯줄 또는 EC를 분리하는 데 이미 사용된 탯줄에서 분리합니다.탯줄을 5cm 길이로 자릅니다. 각 조각을 세로로 잘라 혈관(2개의 동맥[흰색, 단단함]과 1개의 정맥[노란색, 팽창])을 드러냅니다.
   2. 멸균 가위와 집게를 사용하여 혈관을 제거하고 버립니다. 모든 조직을 2-3mm³ 조각으로 자릅니다. 집게를 사용하여 2 - 3 mm³ 조각을 50 ml 원심 분리 튜브에 넣습니다.
   3. 100mg/ml 스톡 콜라겐분해효소 II형을 해동하고 10ml PBS에 1:100을 1mg/ml의 최종 농도로 희석합니다.20,000U/ml 스톡 히알루로니다아제를 해동하고 콜라겐분해효소 용액에서 최종 농도 50U/ml로 1:400으로 희석합니다.
   4. 조직 조각이 들어 있는 원심분리기 튜브에 효소 칵테일을 추가합니다. 느린 회전기에서 37°C에서 5시간 동안 조직 조각을 배양합니다.
   5. PBS에서 세포 현탁액을 1:5로 희석합니다. 100μm 기공 필터를 새 50ml 원심분리기 튜브에 넣습니다. 셀 현탁액을 100μm 공극 필터에 붓습니다.
      메모: 나머지 조직 조각은 필터에 유지되고 세포는 50ml 원심분리기 튜브에 수집됩니다.
   6. 필터를 폐기합니다. RT에서 10분 동안 400 x g에서 세포 현탁액을 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 12ml 완전한 WJMSC 배양 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM low glucose, 10% fetal calf serum (FCS) 및 100 U/ml 페니실린 + 100 μg/ml 스트렙토마이신 혼합물)에 WJMSC 펠렛을 재현탁합니다.
   7. 모든 세포를 75cm² 조직 배양 플라스크에 파종합니다. 24시간 후에 12ml의 완전한 WJMSC 배양 배지로 배지를 교체하십시오. 배지를 2 - 3일마다 교체하십시오. 세포는 2주 이내에 70 - 80% 합류점에 도달해야 합니다. WJMSC가 70 - 80% 합류점에 도달할 때의 통과(섹션 1.4 참조).
3. 골수 유래 MSC(BMMSC)의 팽창:
   1. 앞서 설명한 바와 같이 인간 골수 유래 MSC(BMMSC)를 분리합니다. 10ml의 예열된 중간엽 줄기 세포, MSC 성장 배지(MSCGM)를 15ml 원심분리 튜브에 추가합니다.
   2. 37°C 수조에 2분 동안 넣어 p2 BMMSC 바이알을 해동합니다.MSCGM이 들어 있는 원심분리기 튜브에 BMMSC 현탁액을 추가합니다. 피펫팅으로 잘 섞습니다.
   3. 상온에서 5분 동안 400 x g에서 원심분리기. 상층액을 완전히 흡인합니다.
   4. 1ml MSCGM에 세포를 재현탁하고 혈구계 또는 셀로미터와 같은 디지털 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수합니다.
   5. 12ml MSCGM에서 cm²당 5,000 - 6,000 세포의 밀도로 세포를 75cm2 배양 플라스크에 파종합니다. 24시간 후에 12ml MSCGM으로 배지를 교체하십시오. 2 - 3일마다 12ml MSCGM을 세포에 공급합니다.
   6. BMMSC가 70 - 80% 합류점에 도달할 때의 통과(섹션 1.4 참조). 세포는 섬유아세포 형태를 나타냅니다(그림 1Aii).
4. EC와 MSC의 분리:
   1. 25cm² 배양 플라스크에서 배지를 흡입합니다. 0.02% 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 2ml를 약 2분 동안 첨가합니다. EDTA를 흡인하고 트립신 2ml(2.5mg/ml)를 추가합니다. 세포가 둥글게 될 때까지 현미경으로 봅니다.
   2. 플라스크를 탭하여 셀을 분리합니다. 8ml 배양 배지를 추가하여 트립신을 비활성화합니다(세포 유형에 따라 다름; HUVEC용 EC 배지, WJMSC용 DMEM LG, BMMSC용 MSCGM)을 배양 플라스크에 넣고 현탁액을 15ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
   3. RT에서 5분 동안 400 x g에서 원심분리기. 상층액을 흡입하고 아래 설명된 대로 펠릿을 재현탁합니다.
      1. MSC의 계대 배양을 위해 펠릿을 3ml 배양 배지에 재현탁합니다. 11ml 배양 배지를 3개의 75cm² 배양 플라스크에 추가합니다. 각 배양 플라스크에 1ml 세포 현탁액을 추가합니다(1:3 분할). 공동 배양 분석에 사용하기 전에 WJMSC 및 BMMSC를 3회(p3) 통과시킵니다.
      2. 접착 분석에서 EC 또는 MSC 시딩에 대해서는 섹션 2 및 3을 참조하십시오.
5. 냉동 MSC:
   1. 3번 단계에서 섹션 1.4에 설명된 대로 MSC를 분리합니다. 상층액을 흡입하고 3ml의 얼음처럼 차가운 CryoSFM에 재현탁합니다. 세포 현탁액의 분취액을 1.5ml 얼음처럼 차가운 cryovials로 피펫팅합니다. 냉동 용기에 냉동 식품을 넣으십시오.
   2. 용기를 -80°C O/N에서 보관하십시오. 액체 질소로 옮깁니다. MSC 바이알을 해동합니다(1.3.1 - 1.3.6 단계 수행). MSC를 5ml 배양 배지(WJMSC 또는 BMMSC에 적합한 배지 선택)에 재현탁하고 25cm² 플라스크에 파종합니다.

2. 필터에서 내피-중간엽 줄기세포 공동 배양 설정

1. 섹션 1.4에 설명된 대로 WJ 또는 BMMSC를 분리합니다. 펠릿을 1ml MSCGM에 재현탁시킵니다. 혈구계(hemocyometer) 또는 세포계(cellometer)를 사용하여 세포 계수를 수행합니다.
2. MSCGM의 500μl에서 최종 농도가 5 x 10⁵ MSC가 되도록 부피를 조정합니다.
3. 멸균 겸자를 사용하여 6-well, 0.4μm PET Transwell 필터를 뒤집어 멸균 상자에 넣습니다.
4. 5 x 10⁵ MSC를 필터의 외부 표면에 파종합니다. 37°C 및 5% CO₂에서 1시간 동안 필터를 배양합니다.
5. 필터의 외부 표면에서 매체를 수집합니다. 미디어에서 준수하지 않는 MSC의 수를 계산합니다. 멸균 집게를 사용하여 필터를 다시 뒤집고 3ml MSCGM이 들어 있는 일치하는 6웰 플레이트에 넣습니다.
6. 필터 내부 표면에 MSCGM 2ml를 추가합니다(그림 1B). 37 ° C와 5 % CO₂의 인큐베이터에 24 시간 동안 놓습니다. EC 25cm² 플라스크의 합류점을 트립신화합니다(그림 1Ai, 섹션 1.4).
7. 8ml MSCGM(1 x 25cm² 플라스크는 4개의 6웰 필터를 시드합니다. ~5 x 10⁵ EC/필터)에 EC를 재현탁시킵니다. 다공성 필터의 상단과 하단에서 매체를 흡입합니다. 3ml의 신선한 MSCGM 을 하단 챔버(필터 아래)에 추가합니다. 각 필터의 내부 표면에 2ml EC 현탁액을 추가합니다. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 1 시간 동안 배양합니다.
8. 배지를 흡입하여 비접착성 EC를 씻어내고 새 MSCGM으로 교체하십시오. MSC를 먼저 시딩하지 않고 내부 표면에 세포를 시딩하여 병렬 EC 단일 배양 필터를 설정합니다. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 O / N을 배양합니다.
9. EC 단층이 합류하고 갭이 없는지 확인합니다. Sub-confluent monolayer는 접착 분석에 사용할 수 없습니다(그림 1B).
10. 1 x 10⁵ U/ml 스톡 종양 괴사 인자-알파(TNFα)를 해동하고 MSCGM을 1:1,000으로 최종 농도 100 U/ml(~10 ng/ml에 해당)로 희석합니다. MSCGM에서 100 U/ml TNFα를 1:10으로 희석하여 10 U/ml를 얻어 연속 희석을 수행합니다. MSCGM에서 10 U/ml TNFα를 1:10으로 희석하여 1 U/ml를 얻습니다.
11. 분석 전 4시간 동안 37°C에서 100U/ml TNFα(~10ng/ml에 해당)로 필터의 상부 및 하부 챔버를 처리합니다.

3. 백혈구의 분리

1. 건강한 지원자의 정맥 혈액을 채취하여 즉시 EDTA 튜브로 분취합니다. 튜브를 부드럽게 뒤집어 섞습니다.
2. 10ml 둥근 바닥 튜브에 2.5ml Histopaque 1119에 2.5ml Histopaque 1077을 레이어링합니다. 전혈 5ml를 히스토파크 그라디언트에 겹겹이 쌓습니다. 800 x g에서 상온에서 40분 동안 원심분리기.
3. Histopaque 1077 및 1119(적혈구층 위)의 계면에서 말초 다형성 핵 호중구(PMN)를 수확합니다. 바닥이 둥근 10ml 튜브에 넣고 PBSA로 10ml까지 메이크업합니다. 튜브와 원심분리기를 400 x g에서 실온에서 5분 동안 부드럽게 뒤집습니다.
4. 7.5% BSA 용액을 100ml PBS(칼슘 및 염화마그네슘 포함)에 1:50으로 최종 농도 0.15%(w/v; PBSA)에 있습니다. 상층액을 흡입하고 10ml PBSA에 재현탁합니다. 400 x g에서 상온에서 5분 동안 원심분리기.
5. PBSA 1ml에 재현탁합니다. 세포 현탁액의 20μl 분취액을 취하여 380μl PBSA(1:20 희석)에 추가합니다. 혈구계 또는 세포계를 사용하여 세포를 계수합니다. PBSA에서 필요한 농도(1 x 10,⁶/ml, Transwell 필터 및 Ibidi 마이크로슬라이드)로 희석합니다. 분석이 이루어질 때까지 RT에서 호중구 현탁액을 유지합니다.

4. 플로우 시스템 조립

1. 그림 1C와 같이 흐름 시스템을 설정합니다. 히터를 켜고 37°C로 설정합니다.20ml 주사기(플런저 제거)와 5ml 주사기를 3방향 탭에 부착합니다. Micropore 테이프를 사용하여 Perspex 챔버에 탭을 부착합니다.
2. 밸브와 3방향 탭 사이의 거리와 비슷한 2/4mm(두께)의 긴 실리콘 튜브 조각을 측정하고 자릅니다. 8 - 10 mm 길이의 1/3 mm (얇은) 튜브 조각을 자르고 두꺼운 튜브의 한쪽 끝에 삽입합니다. 두꺼운 튜브 면을 3방향 탭에 부착합니다.
3. 얇은 튜브 끝을 전자 3방향 마이크로밸브의 포트에 연결합니다. 이것이 "세척 저장소"입니다. 6-8mm 길이의 두껍고 얇은 튜브 조각을 자릅니다.
4. 두꺼운 튜브의 한쪽 끝에 얇은 튜브를 삽입합니다. 두꺼운 튜브 끝을 2ml 주사기에 부착합니다(플런저 제거).
5. 2ml 주사기의 얇은 튜브 끝을 전자 마이크로밸브의 포트에 연결하여 "샘플 저장소"를 만듭니다. 마이크로 밸브와 현미경 스테이지 중앙 사이의 거리인 긴 얇은 튜브 조각을 측정하고 절단하여 밸브를 필터 흐름 챔버에 연결합니다.
6. 마이크로슬라이드 모델의 경우 8 - 10mm 두께의 튜빙 조각을 얇은 튜빙 끝에 부착합니다. 두꺼운 튜브 끝에 L자형 커넥터를 놓습니다. 그러면 마이크로슬라이드에 연결됩니다. 필터 모델의 경우 튜브를 얇은 튜브 끝에 연결하는 8 - 10mm 크기의 Portex Blue Line 압력계를 부착합니다.
7. 얇은 튜브 끝을 마이크로 밸브에 놓습니다. 이것은 세척 및 샘플 저장소의 일반적인 출력입니다. PBSA로 저장소를 채웁니다. 기포를 제거하기 위해 PBSA를 통해 튜브를 흐르게 하여 튜브를 프라임합니다.
8. 압력계 튜브를 29mm(50ml) 유리 주사기에 부착합니다. 주사기에 PBSA 10ml를 채워 프라임합니다. 튜브에 연결된 끝이 위쪽을 향하도록 주사기를 뒤집고 모든 기포를 밀어냅니다. PBSA 5ml로 다시 리필합니다.
9. 마이크로슬라이드 모델의 경우에만 10 - 12mm 두께의 튜브를 유리 주사기로 이어지는 압력계 튜브 끝에 부착합니다. 두꺼운 튜브 끝에 L자형 커넥터를 놓습니다. 주입/회수를 위해 유리 주사기를 주사기 펌프에 넣습니다.
10. 다음 공식을 사용하여 0.1Pa(Transwell 필터) 또는 0.05Pa(Ibidi 마이크로슬라이드)의 원하는 벽 전단 응력(Pascal, Pa의 τ_w)을 생성하는 데 필요한 리필 유량(Q)을 계산합니다.
    γ_w = (6. Q) / (w.h²)
    τ = n.γ
    여기서 w = 내부 너비 및 h = 유동 채널의 내부 깊이. n = 유동 용액의 점도; PBSA는 n = 0.7mPa.s입니다. 평행판 필터 플로우 챔버의 경우 너비(w)는 4mm이고 깊이(h)는 0.133mm입니다. 챔버의 깊이는 사용된 Parafilm 개스킷의 두께 차이로 인해 약간 달라질 수 있습니다. Ibidi 마이크로슬라이드의 경우 너비는 3.8mm이고 깊이는 0.4mm입니다.
    메모: 유동 채널의 치수와 캡처 동역학의 차이로 인해 필터 모델과 비교하여 마이크로슬라이드 모델에 대해 다른 전단 응력을 사용합니다.

5. 필터를 통합한 병렬 플레이트 흐름 챔버 설정

1. 금속 템플릿을 사용하여 파라필름 조각(유리 커버슬립과 같은 크기)을 자릅니다. 금속 템플릿을 사용하여 파라필름에서 20 x 4mm 슬롯을 잘라냅니다(흐름 채널을 만들기 위해). 개스킷을 사용하여 유리 커버슬립의 흐름 채널을 표시합니다.
2. 유리 커버슬립에 6웰 필터의 가장자리를 맞춥니다. 필터가 흐름 채널 표시를 덮고 있는지 확인하십시오. 10A형 메스를 사용하여 필터를 조심스럽게 잘라냅니다.
3. 파라필름 개스킷으로 필터를 조심스럽게 덮고 흐름 채널 슬롯이 필터 중앙에 있는지 확인합니다(그림 1D). 깨끗한 티슈 조각을 사용하여 거품을 밀어냅니다.
4. 커버슬립을 Perspex 플로우 챔버의 바닥판 홈에 놓습니다. 상단 Perspex 플레이트를 개스킷 상단 위에 놓고 플레이트를 함께 조입니다(그림 1D).
5. 3방향 탭을 돌려 세척 버퍼(PBSA)가 밸브를 통해 흐르도록 합니다. 압력계 튜브를 상단 Perspex 플레이트의 입구 포트에 연결합니다. 기포가 통과할 수 있도록 흐름 채널을 통해 PBSA를 실행합니다.
6. 주사기 펌프의 압력계 튜브를 Perspex 플레이트의 출구 포트에 연결합니다. 주사기 펌프를 다시 채우도록 설정하고 실행을 누릅니다. 챔버의 상판에 떨어진 PBSA를 청소합니다.
7. 챔버를 무대에 놓습니다.tage 반전 위상차 현미경. 초점을 조정하여 필터 위의 EC를 시각화합니다(그림 1B).

6. 내피 세포를 통한 백혈구의 관류

1. 정제된 호중구 2ml를 샘플 저장소에 넣고 2분 동안 따뜻하게 둡니다. PBSA로 내피를 2분 동안 세척합니다.
2. 밸브를 켜서 호중구를 내피 위로 관류시킵니다. 호중구 볼루스를 4분 동안 전달합니다. 밸브를 끄고 나머지 실험 동안 세척 저장소에서 PBSA를 관류합니다.
3. 기포가 EC 단층을 방해하고 부착 호중구의 박리를 유발할 수 있으므로 분석 중 어느 지점에서도 유동 채널을 통과하지 않도록 하십시오.

>7. 호중구 캡처 및 동작 기록

1. 호중구 흐름 중 또는 관류 후 호중구 동원을 기록합니다.
2. 흐름 채널 중앙에서 최소 5 - 10개의 필드에 대한 모든 디지털 기록을 수행합니다. 대물렌즈를 입구 포트의 채널 가장자리로 이동하고 포트의 중간을 식별하여 채널의 중심을 식별합니다.
   1. 호중구 흐름 중 기록을 위해 10초마다 1분 동안 단일 필드의 이미지를 촬영하고 채널을 따라 이동하여 1분 동안 다른 필드를 기록합니다. 볼루스 기간 동안 반복합니다.
   2. 관류 후 기록의 경우, 백혈구 거동을 평가하기 위해 유동 채널 중앙에서 5 - 10개 필드를 10초 동안 기록하여 백혈구 거동을 평가합니다(일반적으로 호중구 볼루스 종료 후 2분 후). 10초 간격 내에서 1초마다 이미지를 촬영합니다. 이를 통해 흐름에서 포획하고 부착된 호중구의 거동을 분석할 수 있는 충분한 시간을 확보할 수 있습니다.
   3. 최소 10개의 전이된 호중구를 포함하는 단일 필드를 5분 동안 기록하고 30초마다 이미지를 촬영합니다. 이것은 마이그레이션된 세포(내피 위 또는 아래)의 속도를 계산하는 데 사용할 수 있습니다.
   4. 또 다른 일련의 10초 필드를 기록합니다(일반적으로 관류 후 9분). 이것은 호중구가 내피 단층을 통해 이동할 시간을 허용합니다.
   5. 실린지 펌프를 중지하고 튜브를 제거합니다. 플로우 챔버를 분해하고 샘플 저장소와 튜브를 헹굽니다. 후속 필터/마이크로슬라이드 채널에 대해 반복합니다.

8. 백혈구 모집 및 행동 분석

1. 2분 시점에서 10초 동안 기록하는 동안 각 필드에 있는 호중구의 수를 계산합니다. 모든 셀이 계산되려면 첫 번째-두 번째 필드에 있어야 합니다. 시야의 2면(예: 상단/오른쪽 테두리)에서 부분적으로 필드에 있는 셀은 전체 10초 동안 필드에 남아 있는 한 카운트에 포함됩니다.
2. 필드당 부착 호중구의 평균 수를 계산합니다. 기록된 필드의 길이와 너비를 측정합니다. 필드의 면적을 계산합니다. 1mm²에 얼마나 많은 필드가 있는지 계산합니다. 평균 호중구 수에 1mm²의 필드 수를 곱합니다.
3. 관류된 호중구의 양(예: 2 x 10⁶/ml*Q[예: 평행 플레이트 유동 챔버의 경우 0.0999ml/min])에 볼루스의 지속 시간(예: 4분)을 곱하여 관류된 총 호중구 수를 계산합니다.
4. 호중구 수/mm²를 관류된 총 호중구 수로 나누어 부착한 총 세포 수(부착 세포/mm² / 10⁶ 관류)를 결정합니다.
5. 부착된 호중구가 굴러가고 있는지, 단단히 부착되어 있는지, 또는 전이되고 있는지 평가합니다.
   1. 굴러다니는 호중구는 위상이 밝으며 내피 단층(1 - 10 μm/sec)을 따라 천천히 움직입니다.
   2. 단단히 부착된 세포는 위상이 밝고 EC 표면에 결합되어 정지 상태를 유지하거나(즉, 기록 중에 움직이지 않음) 형태 변화를 겪어 EC 표면을 통해 이동합니다(그림 1Ei).
   3. 전이된 호중구는 위상이 어둡고 EC 층 아래에 있습니다(그림 1Eii).
6. rolling, stationary 및 transmigration된 부착 세포의 비율을 계산합니다. 또는 호중구 거동은 총 접착을 계산하는 데 사용되는 것과 동일한 공식을 적용하여 다른 행동을 보이는 총 세포 수로 표현할 수 있습니다(8.6 - 8.7 단계에서 설명).
   1. 굴러가는 호중구의 앞쪽 가장자리를 표시합니다. 10초 시퀀스의 끝에 있는 동일한 셀의 선행 가장자리를 표시합니다. 2개의 점 사이에 선을 긋고 세포가 이동한 거리를 측정합니다.
   2. 이 값을 셀이 굴러가는 기록 기간(즉, 10초)으로 나눕니다. 전체 10초 간격 동안 필드에 있는 호중구를 선택해 보십시오.
7. 표면 위로(모양, 변화된 위상, 밝음) 또는 내피 아래(위상 암흑)로 이동하는 호중구의 속도를 계산하려면 5분 기록을 사용하십시오.
   1. 시퀀스의 시작 부분에 마이그레이션된 셀의 윤곽선을 그리고 시퀀스 전체에서 셀을 추적하는 방법을 추적합니다. 각 셀에 대해 각각 1분 간격으로 중심의 X 및 Y 위치를 기록해 둡니다. 시퀀스의 첫 번째 이미지에 있는 X 및 Y 위치의 값을 두 번째 이미지의 값에서 뺍니다. 이것은 피타고라스의 정리에 기초합니다.
   2. 세 번째 이미지에서 두 번째 이미지의 값을 뺍니다. 시퀀스의 모든 이미지에 대해 이 작업을 수행합니다. X 및 Y 값을 제곱하고 함께 더합니다.
   3. 결과 값의 제곱근. 각 분 간격에서 계산된 속도의 평균을 구하여 각 셀의 속도를 계산합니다. 10개의 마이그레이션된 호중구를 추적하고 평균 속도를 계산합니다.

결과

그림 1. EC-MSC 공동 배양을 확립하고 유동 기반 접착 분석을 사용하여 호중구 동원을 분석합니다. (A) 조직 배양 플라스크에서 성장한 (i) 1차 EC 및 (ii) 통로 3 BMMSC의 현미경 사진. (B) 6-well Transwell 필터 인서트에서 배양된 EC 및 MSC의 현미경 사진. (C) 흐름을 생성하는 데 사용되는 관류 시스템의 다이어그램. (D) 병렬 플레이트 필터 흐름 챔버의 개략도. (E) 100 U/ml TNFα로 자극된 흐름에서 EC로의 동원 후 (i) 단단히 부착된(FA) 및

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
콜라겐 분해 효소 Ia 형	시그마	C2674	10ml PBS에 희석하여 10mg/ml의 최종 농도를 얻습니다. -20°C에서 1ml 분취액에 보관하십시오.
둘베코의 PBS	시그마	D8662	칼슘과 염화마그네슘 함유. 멸균 상태로 보관하고 실온에서 보관하십시오.
1X 중형 M199	지브코	제31150-022	사용하기 전에 37°C의 수조에서 따뜻하게 하십시오.
겐타마이신 황산염	시그마	G1397	4°C에서 보관하세요.M199 500ml 병에 넣으세요.
인간 표피 성장 인자	시그마	E9644	-20°C에서 10μl 분취액에 넣어 보관하십시오.
송아지 태아 혈청(FCS)	시그마	F9665	FCS는 분리된 EC의 성장과 생존 가능성을 보장하기 위해 배치 테스트를 거쳐야 합니다. 56°C에서 불활성화를 가열하고 -20°C에서 10ml 분취액에 보관하십시오.
암포테리신 B	지브코	제15290-026	강력하고 일주일 이내에 독성이 있으므로 매주 신선한 완전한 HUVEC 배지를 만들어야 합니다. -20°C에서 1ml 분취액에 넣어 보관하십시오.
하이드로코르티손	시그마	H0135	스톡은 에탄올에 들어 있습니다. -20°C에서 10μl 분취액에 넣어 보관하십시오.
콜라겐분해효소 II형	시그마	C6885	PBS의 육수를 최종 농도 100mg/ml로 희석하고 -20°C에서 100μl 분취액에 보관합니다.
히알루로니다아제	시그마	H3631	PBS의 스톡을 최종 농도 20,000U/ml로 희석하고 -20°C에서 100μl 분취액에 저장하십시오.
50ml 원심분리기 튜브용 100μm 세포 스트레이너	과학 실험실 용품 (SLS)	제352360	다른 상업적으로 이용 가능한 세포 여과기(예: Greiner bio-one)도 사용할 수 있습니다.
DMEM 저포도당	바이오세라	LM-D1102/500	사용하기 전에 37°C의 수조에서 따뜻하게 하십시오.
페니실린/스트렙토마이신 믹스	시그마	P4333	-20°C에서 1ml 분취액에 넣어 보관하십시오.
25cm2 조직 배양 플라스크	증권 시세	353109
75cm2 조직 배양 플라스크	증권 시세	353136
골수 중간엽 줄기세포 바이알	론자	태평양 표준시 - 2501	도착 시 액체 질소에 넣어 보관하십시오. 세포는 도착 시 통로 2에 있지만 통로 0으로 지정됩니다. 통로 3으로 확장하고 나중에 사용할 수 있도록 액체 질소에 보관하십시오.
중간엽 줄기세포 성장 배지(MSCGM)	론자	PT-3001	사용하기 전에 37°C의 수조에서 따뜻하게 하십시오. Cell Tracker Green 염색의 경우 FCS가 없는 배지를 사용하십시오.
EDTA (0.02 %) 용액	시그마	E8008	4°C에서 보관하십시오. 사용하기 전에 37°C 수조에서 데우십시오.
트립신 용액	시그마	T4424	-20°C에서 2ml 분취액에 넣어 보관하십시오. 실온에서 해동하고 즉시 사용하십시오.
크라이오비알(Cryovials)	그라이너 바이오 원	2019-02	세포 현탁액을 추가하기 전에 추가하기 전에 얼음에 보관하십시오.
Mr. Frosty 냉동 용기	날진	5100-0001	실온에서 보관하십시오. 세포가 있는 cryovials를 추가할 때 세포를 액체 질소로 transfrring하기 전에 -80°C에서 24시간 동안 보관하십시오.
세포 추적기 녹색 염료	생명 기술	C2925	-20°C에서 5μl 분취액에 보관하고 예열된 5ml(37°C) MSCGM에 희석합니다.
세포 계수 챔버	넥셀롬	SD-100	또는 혈구계를 사용할 수 있습니다.
셀로미터 자동 T4 셀 카운터	넥셀롬	자동 T4-203-0238
종양괴사인자 α(TNFα)	R&D 시스템	210-타-100	PBS의 재고를 최종 농도 100,000U/ml로 희석하고 -80°C에서 10μl 분취액에 저장하십시오.
6웰, 0.4μm PET 트랜스웰 필터	증권 시세	353090
10ml 튜브의 K2-EDTA	사르슈테트		실온에서 보관하십시오.
히스토파케 1119	시그마	11191	4°C에서 보관하십시오. 사용하기 전에 실온으로 데우십시오.
히스토파케 1077	시그마	10771	4°C에서 보관하십시오. 사용하기 전에 실온으로 데우십시오.
10ml 둥근 바닥 튜브	애플턴 우즈	SC211 142 AS
7.5% BSA 분수 V 용액	생명 기술	제15260-037	4°C에서 보관하십시오.
20ml Plastipak 주사기	BD 팔콘	300613
5ml Plastipak 주사기	BD 팔콘	302187
2ml Plastipak 주사기	BD 팔콘	300185
3M 저자극성 수술용 테이프 9m x 2.5cm	미세공(Micropore)	1530-1	주사기 탭을 방풍 챔버의 벽에 고정하는 데 사용합니다.
실리콘 고무 튜브, 1/3mm의 내경/외경(ID/OD)(얇은 튜브)	피셔 사이언티픽	FB68854	실리콘 튜브를 적절한 크기로 자릅니다. 전자 마이크로밸브로 직접 연결되는 모든 튜브는 얇아야 합니다.
실리콘 고무 튜빙 ID/OD 2/4mm(두꺼운 튜빙)	피셔 사이언티픽	FB68855
Portex 블루 라인 압력계 튜빙	스미스	200/495/200	주사기 펌프로 이어지는 튜브.
3방향 스톱콕	BOC 오메다 AB
펌프용 유리 50ml 주사기	포퍼 마이크로메이트	550962	사용하기 전에 기포를 제거하여 프라이밍해야 합니다.
유리 커버슬립	레이몬드 어 램		26x76mm 커버 슬립은 주문 제작되었습니다. 로트 번호 2440980.
파라필름 개스킷	아메리칸 내셔널 캔 컴퍼니		알루미늄 템플릿을 사용하여 26x76mm 파라필름 조각을 자르고 메스 10a를 사용하여 20x4mm 슬롯을 자릅니다. 개스킷 두께는 약 133μm입니다.
두 개의 방풍 평행 플레이트	Wolfson 응용 기술 연구소		8개의 나사로 함께 고정되는 평행 플레이트로 구성된 특별히 설계된 챔버. 하부 플레이트에는 중간에 돌출된 시야 슬롯과 커버슬립, 필터 및 개스킷을 위한 공간을 허용하기 위해 밀링된 얕은 홈이 있습니다. 상부 방풍판에는 흐름 채널 위에 위치한 입구 및 출구 구멍이 있습니다.
최소 데드 스페이스가 있는 전자식 3방향 마이크로밸브	리 제품 회사	LFYA1226032H	12볼트 DC 전원 공급 장치에 전자적으로 연결됩니다.
주입/회수용 주사기 펌프(PHD2000)	하버드 기구	70-2001	직경을 29mm로 설정하고 리필(유량) 속도를 설정합니다.
L자형 커넥터	라부트	LE876	Ibidi 마이크로슬라이드 채널의 입구 및 출구 포트에 부착합니다.
비디오 카메라	큐이미징	01-QIC-F-M-12-C	digitall 비디오를 녹화할 수 있는 컴퓨터에 연결됩니다.
이미지-프로 플러스 7.0	미디어 사이버네틱스	41N70000-61592	데이터 분석용. 다양한 동작을 표시하는 셀에 수동으로 태그를 지정합니다. 롤링 및 이동 속도 분석을 위해 세포를 추적합니다.

호 호 조 표시기 표시기 시리즈 년 시리즈 표시기 년 년 호 년 년