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1. 배양된 암세포에서 화학요법 약물에 의한 노화 유도
참고: 이 섹션의 모든 세포 조작 단계는 멸균 방법을 사용하여 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다. 이 섹션은 부착성 세포 유형에 대해 작성되었습니다. 현탁 세포는 언급된 바와 같이 적절한 변형과 함께 사용될 수 있습니다.
- 사용된 특정 세포주를 제공한 공급업체 또는 실험실의 표준 프로토콜에 따라 암 세포주를 성장시킵니다.
메모: 낮은 계대 세포(p < 10)는 처리되지 않은 세포 샘플에서 복제 노화 수준이 낮기 때문에 일반적으로 선호됩니다.
- 약물에 의한 노화 유도 하루 전에 트립신-EDTA 0.25%(또는 권장에 따라)로 세포를 채취합니다. 동일한 부피의 완전한 배양 배지를 추가하여 트립신을 중화하고 세포 현탁액을 멸균 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
메모: 이 단계는 부유 세포에는 필요하지 않습니다.
- 표준 혈구계 방법을 사용하여 세포를 계수하고 세포/mL를 기록합니다. 플레이트 셀 1 × 10 3-10 × 103 cells/cm2 in standard 6-well plastic culture dish.
메모: 최적의 도금 밀도는 세포의 증식 속도에 따라 달라지며 사용자가 결정해야 합니다. 세포는 치료 시점에 약 10%-20% 포화도에서 대수상 성장해야 합니다(즉, 도금 후 18-24시간 배양 후). 현탁 세포의 시작 밀도(cells/mL)는 사용자가 결정해야 합니다. 6-well plate는 일반적으로 하나의 standard 유세포 분석 샘플에 대해 well당 충분한 노화 cell을 생성합니다. 유동 분류의 경우, 다운스트림 분석을 위해 충분한 수의 노화 세포를 회수할 수 있도록 훨씬 더 큰 표면적(예: 여러 P150 플레이트)을 사용해야 합니다(≥1 × 10,6).
- 도금된 세포를 5% CO2와 습도 팬이 있는 37°C 인큐베이터에서 밤새(18-24시간) 배양합니다.
- 노화를 유발하는 화학 요법 약물로 도금된 세포를 치료합니다. 하나 이상의 양성 대조군, 예를 들어, 에토포사이드(ETO) 또는 블레오마이신(BLM)을 포함합니다. 약물별로 중복 웰을 준비합니다. 차량 전용 처리된 한 세트를 control.
으로 포함합니다.
메모: 사용자는 사용 중인 세포주에서 노화 유도를 위한 최적의 농도를 결정하기 위해 각 실험제에 대한 용량 곡선을 테스트해야 합니다.
- 37% CO2와 습도 팬이 있는 5°C 인큐베이터에서 4일 동안 세포를 배양하여 노화를 시작합니다. 광학 현미경을 사용하여 예상되는 형태 변화를 매일 검사합니다.
메모: 3-5일의 잠복기는 노화 발병 속도에 따라 허용될 수 있습니다. 배지를 변경하고 원하는 대로 제제를 재도포(또는 적용하지 않음)하여 건강한 성장 조건을 촉진하는 동시에 허용 가능한 비율의 노화 세포를 달성할 수 있습니다.
- 노화가 시작된 후 37°C에서 5분 동안 트립신-EDTA 0.25%를 첨가하여 세포를 수확합니다. 세포가 현탁액으로 해리될 때, 동일한 부피의 완전한 배지로 트립신을 중화합니다.
메모: 이 단계는 현탁액에서 성장하는 세포에는 필요하지 않습니다. 표면 마커 염색을 수행할 경우 세포의 표면 항원을 일시적으로 파괴할 수 있으므로 트립신-EDTA의 사용을 피하십시오. 대신, 멸균 플라스틱 세포 스크레이퍼(또는 표면 항원을 보존하도록 설계된 대체 해리 시약)를 사용하여 단층을 부드럽게 해리합니다.
- 혈구계를 사용하여 각 샘플의 세포를 계수합니다. 각 샘플의 셀/mL를 계산합니다.
메모: 이 시점에서(즉, 약물 치료로 인해) 죽은 세포의 비율을 평가하기 위해 트리판 블루를 추가할 수 있지만, DDAOG 염색 워크플로우 중에 형광 생존도 염료로 세포 사멸을 측정할 수도 있습니다.
- 샘플당 ≥0.5 × 106개 세포를 1.7mL 마이크로 원심분리 튜브에 분취합니다.
메모: 샘플당 세포 수는 모든 샘플에서 표준화되어야 합니다.
- 4°C의 마이크로 원심분리기에서 1,000×g으로 5분 동안 튜브를 원심분리합니다.상층액을 제거합니다.
메모: 냉장 마이크로 원심분리기를 사용할 수 없는 경우, 특정 탄력적인 세포 유형에 대해 상온에서 원심분리를 수행하는 것이 허용될 수 있습니다.
- 섹션 2에서 DDAOG 염색을 진행합니다.
2. 세포 샘플에서 SA-β-Gal의 DDAOG 염색
- 1mM Bafilomycin A1 스톡을 1:1,000x로 DMEM 배지(FBS 제외)에 희석하여 최종 농도를 1μM로 만듭니다.
- 준비된 Baf-DMEM 용액을 세포 펠릿 샘플(단계 1.11)에 1 × 106 cells/mL.
의 농도로 추가합니다.
메모: 예를 들어, 샘플당 0.5 × 106 셀을 사용하는 경우 0.5mL의 Baf-DMEM을 추가합니다.
- 37 ° C (CO2 없음)에서 느린 속도로 설정된 회전 장치 / 셰이커에서 30 분 동안 배양합니다 .
메모: 용액을 산성화하여 Baf 및 DDAOG 염색을 방해할 수 있는 염색 공정에 CO2 인큐베이터를 사용하지 마십시오.
- 세척하지 않고 1:500x(10μg/mL 최종)의 DDAOG 원액(5mg/mL)을 각 샘플에 추가합니다. 혼합할 피펫. 37°C(CO2 제외)의 로테이터/셰이커에서 60분 동안 교체합니다. 직사광선을 피하십시오.
- 4°C에서 1,000 x g에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 상층액을 제거합니다.
- 튜브와 피펫당 얼음처럼 차가운 0.5% BSA 1mL로 세척하여 혼합합니다. 튜브를 4°C에서 1,000 x g에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 이 단계를 2회 반복하여 세포를 철저히 씻습니다. 상층액을 제거하고 계속 진행합니다.
메모: 원치 않는 형광 방출(460/610nm)을 나타낼 수 있는 절단되지 않은 DDAOG를 제거하려면 2.6단계의 세척 단계를 수행하는 것이 중요합니다.
- (선택 사항) 추후 분석을 위한 DDAOG 염색 세포의 고정 및 보관
- 세척된 각 샘플에 얼음처럼 차가운 0.5mL의 4% 파라포름알데히드를 적가합니다. 혼합할 피펫.
- 실온에서 10분 동안 배양합니다.
- PBS 1mL로 세포를 2x 세척합니다.
- 유세포 분석 전에 4°C에서 최대 1주일 동안 샘플을 보관하십시오.
메모: 고정 샘플의 경우 2.8단계를 건너뜁니다.
- Calcein Violet 450 AM 스톡(1mM)을 1:1,000x에서 1% BSA-PBS(1μM 최종)로 희석합니다. 2.6단계에서 세척된 세포 펠릿에 300μL(배양된 세포 샘플의 경우)를 추가합니다. 어둠 속에서 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다.
- 유세포 분석 설정을 진행합니다(섹션 3).
3. 유세포 분석기 설정 및 데이터 수집
- 세포 시료를 유세포 분석 기기와 호환되는 튜브로 옮깁니다. 튜브를 얼음 위에 놓고 빛으로부터 보호하십시오.
메모: 세포 현탁액에서 응집체가 관찰되면 분석 전에 70-100μm 세포 스트레이너를 통해 현탁액을 통과시킵니다. 40μm 스트레이너는 더 큰 노화 세포 중 일부를 제외할 수 있으므로 사용하지 마십시오.
- 참조된 소프트웨어(재료 표 참조)에서 1) FSC-A 대 SSC-A 점도표, 2) 보라색 채널 히스토그램, 3) 원적외선 채널(예: APC-A) 대 녹색 채널(예: FITC-A) 도트 플롯을 엽니다.
메모: Doublet 제외 플롯 및 단일 채널 히스토그램도 사용할 수 있지만 반드시 필요한 것은 아닙니다.
- 유세포 분석기 데이터 수집을 시작합니다.
- 차량 전용 제어 s를 놓습니다.amp흡기 포트에 DDAOG로 염색된 le. 낮은 흡기 속도에서 샘플 데이터를 수집하기 시작합니다.
- 이벤트의 >90%가 플롯 내에 포함되도록 FSC 및 SSC 전압을 조정합니다. 셀이 플롯에 잘 맞지 않으면 영역 배율 설정을 0.33-0.5 단위로 낮춥니다.
- 데이터를 기록하지 않고 차량 전용 샘플을 제거합니다.
- (선택 사항) 1mL의 PBS가 있는 세포분석기 튜브에 무지개 보정 마이크로스피어 한 방울을 추가합니다. 세포분석기 흡입 포트에 튜브를 놓습니다. 샘플 데이터 수집을 시작합니다.
- 무지개 마이크로스피어의 상단 피크가 각 채널에서 상대 형광의 104-105 단위 범위에 있고 모든 피크가 각 채널에서 잘 분리되도록 보라색, 녹색 및 원적외선 채널 전압을 조정합니다. 10,000개의 이벤트를 기록합니다. 튜브를 제거합니다.
- DDAOG로 염색된 양성 대조군 샘플(예: BLM, ETO)을 흡기 포트에 놓습니다. 저속으로 샘플 데이터를 수집합니다. FSC, SSC, 보라색, 녹색 및 원적외선 채널에서 이벤트를 관찰하여 이벤트의 90% 이상이 모든 플롯 내에 포함되어 있는지 확인합니다. 차량 전용 제어와 비교하여 AF 및 DDAOG 신호의 증가를 찾습니다.
- 분류 세포분석기를 사용하는 경우 이 단계에서 분류를 시작하십시오.
- 기록 보관을 위해 대조군 샘플과 분류된 각 샘플에 대해 10,000개의 셀을 기록합니다.
- 원하는 양의 세포(일반적으로 1 × 10,6 ≥)를 3-5mL의 배양 배지가 있는 기기에 적합한 수집 튜브에 분류합니다.
- 정렬 후 다운스트림 배양 또는 분석으로 진행합니다.
메모: 본 명세서에 사용된 보정된 유세포분석기의 경우, 최적 채널 전압은 일반적으로 250 및 600(중간 범위) 사이였지만, 최적 전압 및 채널 전압 범위는 기기에 따라 다를 수 있습니다. 볼륨을 사용하지 마십시오.tages는 신호를 억제하거나 증폭할 수 있는 매우 낮거나 높은 범위에서tages.
- 3.1-3.5단계를 완료하고 필요에 따라 유세포 분석기 설정을 조정한 후 모든 샘플에 대한 데이터를 기록합니다. 모든 s에 대해 설정이 균일하게 유지되는지 확인하십시오.amp르 녹음. 배양된 세포 샘플당 ≥10,000개의 이벤트를 기록합니다.
메모: 게이팅 및 분석은 데이터 수집 소프트웨어(예: FACSDiva)를 사용하여 수행할 수 있지만, 별도의 분석 소프트웨어(FlowJo)를 사용하여 수집 후 수행해야 하는 완전한 게이팅 및 분석 워크플로는 아래 섹션 4에 설명되어 있습니다. 수집 후 분석은 세포분석기 워크스테이션에서의 시간을 줄이고 전용 분석 소프트웨어에 포함된 추가 도구를 활용하기 위해 선호됩니다.
- 샘플 데이터를 .fcs 파일 형식으로 저장합니다. 파일을 유세포 분석 소프트웨어(예: FlowJo)가 설치된 워크스테이션 컴퓨터로 내보냅니다.
4. 유세포 분석 데이터 분석
참고: 제시된 워크플로우는 FlowJo 소프트웨어를 사용합니다. 이 섹션에 설명된 주요 단계를 유사하게 따르는 경우 대체 유세포 분석 데이터 분석 소프트웨어를 사용할 수 있습니다.
- FlowJo 소프트웨어를 사용하여 3.7단계의 .fcs 데이터 파일을 엽니다.
- 레이아웃 창을 엽니다.
- 모든 샘플을 레이아웃 창으로 끌어다 놓습니다.
- 게이트 생존 가능한 세포.
- 먼저 차량 전용 컨트롤에 대한 샘플 데이터를 두 번 클릭하여 데이터 창을 엽니다.
- 데이터를 보라색 채널 히스토그램으로 시각화합니다. CV450에 의해 염색된 생존 가능한 세포는 죽은 세포보다 더 밝은 형광을 기반으로 합니다.
- 단일 게이트 히스토그램 도구를 사용하여 사용 가능한 셀만 포함하는 게이트를 그립니다. 게이트의 이름을 실행 가능으로 지정합니다.
- 그런 다음 Sample Layout 창에서 실행 가능한 게이트를 다른 셀 샘플로 드래그하여 게이트를 균일하게 적용합니다.
- 레이아웃 창에서 모든 샘플을 보라색 채널(생존력) 히스토그램으로 시각화합니다. 진행하기 전에 생존 가능한 세포 게이팅이 샘플 전반에 걸쳐 적절한지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 필요에 따라 조정합니다.
메모: 생존력 염색은 처리에 따라 차이를 보일 수 있습니다.
- 노화 세포를 게이트합니다.
- 차량 전용 컨트롤에 대한 게이트된 실행 가능한 셀 데이터를 두 번 클릭하여 데이터 창을 엽니다.
- 데이터를 원적외선 채널(DDAOG) 대 녹색 채널(AF)에 대한 점도표로 시각화합니다.
- 사각형 게이팅 도구를 사용하여 DDAOG+ 및 AF+(오른쪽 위 사분면)인 셀의 <5%를 포함하도록 게이트를 그립니다. 게이트의 이름을 senescent로 지정합니다.
- 그런 다음 Sample Layout 창에서 senescent gate를 다른 세포 샘플의 실행 가능한 부분 집합으로 드래그하여 게이트를 균일하게 적용합니다.
- 레이아웃 창으로 섹션 4.4에서 제어된 모든 사용 가능한 셀 하위 집합을 끌어다 놓습니다. 모든 실행 가능한 샘플을 녹색 채널(예: FITC-A) 도트 플롯 대 연적외선(예: APC-A)으로 시각화합니다.
- 4.5.3단계에서 그린 노화 게이트가 모든 플롯에서 표시되고 차량 전용 제어에 대한 게이트가 ≤5%-10% 노화 셀을 나타내는지 확인합니다.
- 위의 단계를 사용하여 노화 세포의 백분율이 결정되면 FlowJo 플롯을 사용하여 결과 데이터를 제시하고, 데이터 테이블에 요약하고, 표준 소프트웨어를 사용하여 통계적으로 분석합니다.