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1. 시약의 준비
- 담즙염 배지: 0.4% 담즙염(중량/부피)을 함유한 트립틱 대두 육수(TSB)를 준비하기 위해 50mL 오토클레이브 TSB에 담즙염 200mg을 재현탁합니다. 필터는 0.22μm 필터를 사용하여 멸균합니다. 매주 신선한 매체를 만드십시오.
노트: 일상적으로 사용되는 담즙염은 양과 소의 담낭에서 분리된 소듐 콜레이트와 소듐 데옥시콜레이트의 1:1 혼합물입니다. 앞서 설명한 바와 같이, 포도당의 존재는 담즙염 유도 생물막 형성에 필요했습니다. TSB는 Luria-Bertani(LB) 육수에 비해 포도당을 추가했습니다. 따라서 Shigella 및 분석된 다른 장 병원체에서 생물막 형성을 유도하기에 충분했습니다. 분석할 박테리아에 따라 다른 포도당 농도 또는 다른 설탕 요구량이 필요할 수 있습니다.
- 0.5% w/v 크리스탈 바이올렛을 물에 넣으십시오: 크리스탈 바이올렛 2.5g을 500mL 증류수에 용해시킵니다. 필터는 0.22μm 필터를 사용하여 멸균합니다.
2. 박테리아의 준비
- 멸균 배양 튜브에서 잘 격리된 단일 콜로니를 3mL의 TSB를 접종하여 테스트할 박테리아 균주의 하룻밤 배양을 성장시킵니다. 37 ° C에서 225 rpm으로 흔들어 밤새 배양 (16-24 시간)을 위해 배양합니다.
메모: 균주는 2-4주마다 냉동실 재고에서 회수해야 하며 2주 이상 된 접시에 보관해야 합니다.
3. 고체상 접착 분석
참고: 이 분석은 96웰 플레이트 방법을 사용하여 부착 박테리아를 정량화합니다. 박테리아는 평평한 바닥판에서 정적으로 자랍니다. 비부착성 박테리아를 제거하기 위해 세척을 실시하고 부착성 박테리아를 크리스탈 바이올렛으로 염색합니다. 크리스털 바이올렛 염색은 박테리아 세포벽의 펩티도글리칸과 결합하고 에탄올을 사용하여 가용화될 수 있습니다. 부착 박테리아의 수는 크리스탈 바이올렛 보유에 따라 결정됩니다.
- 2개의 1.5mL 튜브를 설정합니다. TSB 또는 TSB + 담즙염(BS)으로 표지합니다.
- 각 튜브에 TSB 또는 TSB + BS 1mL를 추가합니다.
- 20μL의 야간 배양액으로 튜브를 접종합니다(1:50 희석).
- 바닥이 편평한 멸균 투명, 조직 배양 처리된 96웰 플레이트에서 130μL/웰의 미접종 대조군 배지를 3개의 웰에 추가하여 블랭크 대조군 역할을 합니다. 테스트할 각 매체 유형(TSB 및 TSB + BS)에 대해 3개의 제어 웰을 설정합니다.
- 130μL/웰의 접종된 배양액을 3개의 웰에 추가하고 모든 실험 조건이 3회 플레이팅될 때까지 반복합니다.
- 37 °C에서 4 - 24 시간 동안 정적으로 배양합니다.
- 플레이트 리더를 사용하여 OD600을 기록합니다. 컨트롤 웰을 '블랭크'로 설정합니다.제어 매체가 탁도의 증거 없이 깨끗한지 확인합니다. 탁도가 감지되면 실험을 폐기합니다. OD600 값은 박테리아 균주 간에 성장률에 큰 차이가 있는 경우 데이터를 정규화하는 데 사용할 수 있습니다.
- 플레이트를 부드럽게 기울여 진공 라인을 사용하여 배양 배지를 제거하고 웰의 아래쪽 가장자리에서 배지를 천천히 흡인합니다. 플라스틱 표면에 위치한 부착 박테리아 개체군을 방해하지 않고 모든 배양 배지를 수집해야 합니다. 배양 시간 동안 세포외 다당류(EPS) 매트릭스가 생성된 경우 매트릭스는 흰색 침전물로 시각화됩니다. EPS 매트릭스를 방해하지 마십시오.
- 200μL 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 웰을 한 번 부드럽게 세척합니다. 진공 라인을 사용하여 PBS 세척을 제거합니다.
- 접시를 뒤집어 말리십시오. 건조될 때까지 최소 20분 동안 기다립니다.
메모: 염색하기 전에 생물막을 완전히 건조시켜야 하기 때문에 이 단계에서 프로토콜은 몇 시간 또는 하룻밤 동안 일시 중지할 수 있습니다. 추가된 건조 시간은 염색 절차를 변경하지 않으며 불완전 건조는 결과의 정량화 및 재현성에 영향을 미칩니다.
- 각 실험에 150μL의 0.5% 크리스털 바이올렛을 추가하고 웰을 제어합니다.
- 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다.
- 400μL의 증류수로 웰을 한 번 씻습니다. 추가된 부피는 웰 측면에서 잔류 결정 바이올렛 얼룩을 제거하는 데 도움이 됩니다. 진공 라인으로 세척을 제거하십시오.
- 200μL의 증류수로 웰을 5회 세척합니다. 진공 라인으로 세척을 제거하십시오.
메모: 철저한 세척은 정량화를 위해 중요합니다. 빈 웰이 증류수에서 깨끗해지고 잔류 결정 바이올렛 얼룩이 없으면 다음 단계로 진행합니다.
- 접시를 뒤집어 말리고 빛으로부터 보호하십시오. 위에서 언급한 대로 플레이트가 완전히 건조되었는지 확인하십시오.
- 200μL의 95% 에탄올로 웰을 탈취합니다. 셰이커에서 플레이트를 30분 동안 배양합니다. 특히 더 높은 온도에서 증발을 방지하려면 4°C에서 이 단계를 수행하십시오.
- 플레이트 리더를 사용하여 광학 밀도를 540(OD540)으로 기록합니다.
메모: 크리스탈 바이올렛의 최대 흡광도를 위한 파장은 590nm에 가깝습니다. 문헌에 따르면 결정 바이올렛 흡광도에 대한 OD540 - OD595의 범위; 따라서 플레이트 리더를 기반으로 사용 가능한 파장을 선택하십시오.