EPS Matrix Detection을 통한 담즙염 유도 생물막 형성을 연구하기 위한 분석

초록

출처: Nickerson, K. P., et al. 장 병원체에서 담즙염 유도 생물막 형성: 식별 및 정량화 기술. J. Vis. 특급. (2018).

이 동영상은 담즙염 유도 생물막 형성을 정량화하기 위한 형광 기반 방법을 보여줍니다. 병원성 장 세균의 배양에 담즙염을 첨가하면 생물막의 세포외 고분자 물질(EPS) 매트릭스의 다당류에 결합하는 형광 렉틴을 사용하여 생물막 생성이 감지됩니다.

프로토콜

1. 시약의 준비

1. 담즙염(BS) 배지: 0.4% 담즙염(중량/부피)을 함유한 트립틱 대두 육수(TSB)를 준비하려면 50mL 오토클레이브 TSB에 담즙염 200mg을 재현탁합니다. 필터는 0.22μm 필터를 사용하여 멸균합니다. 매주 신선한 매체를 만드십시오 .
   노트: 일상적으로 사용되는 담즙염은 양과 소의 담낭에서 분리된 소듐 콜레이트와 소듐 데옥시콜레이트의 1:1 혼합물입니다. 앞서 설명한 바와 같이, 포도당의 존재는 담즙염 유도 생물막 형성에 필요했습니다. TSB는 Luria-Bertani(LB) 육수에 비해 포도당을 추가했습니다. 따라서 Shigella 및 분석된 다른 장 병원체에서 생물막 형성을 유도하기에 충분했습니다. 분석할 박테리아에 따라 다른 포도당 농도 또는 다른 설탕 요구량이 필요할 수 있습니다.
2. 0.5% w/v 크리스탈 바이올렛을 물에 넣으십시오: 크리스탈 바이올렛 2.5g을 500mL 증류수에 용해시킵니다. 필터는 0.22μm 필터를 사용하여 멸균합니다.
3. Concanavalin A (ConA)는 fluorescein isothiocyanate (FITC)에 접합됩니다 : 1x PBS에서 스톡을 재구성합니다. 10mg 농축 스톡을 400μL의 1x PBS로 최종 농도 25μg/mL로 희석하고 빛으로부터 보호합니다.
4. PBS + 포도당: 10mL 1x PBS(2% w/v 포도당 최종)에 포도당 0.2g을 용해합니다. 필터는 0.22μm 필터를 사용하여 멸균합니다. 사용 당일에 신선하게 만드십시오.
5. PBS + 담즙염 : 10 mL 1x PBS (0.4 % w / v 담즙염 최종)에 40 mg을 용해시킵니다. 필터는 0.22μm 필터를 사용하여 멸균합니다. 사용 당일에 신선하게 만드십시오.
6. PBS + 포도당 및 담즙염: 40mg 담즙염과 0.2g의 포도당을 10mL 1x PBS(0.4% w/v 담즙염 및 2% w/v 포도당 최종)에 용해시킵니다. 필터는 0.22μm 필터를 사용하여 멸균합니다. 사용 당일에 신선하게 만드십시오.
7. LB 한천 플레이트를 준비합니다.
8. 포름알데히드/글루타르알데히드 고정: 810μL 포름알데히드(37% 원액, 3% 최종 농도) 및 125μL 글루타르알데히드(25% 원액, 0.25% 최종 농도)를 14mL 1x PBS에 추가합니다. 잘 섞어 4 °C에서 보관하십시오. 수정 사항은 올바른 사용을 위해 차가워야 합니다.
   주의: 이 수정 사항은 독성이 있으며 유해 폐기물 처리가 필요합니다.
9. 안티페이드 마운트 솔루션: 박테리아의 DNA를 형광 염색하면서 면역 형광 현미경 샘플의 광표백을 억제하기 위해 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 염색을 포함하는 페이드 방지 마운트 솔루션을 사용합니다.

2. 박테리아의 준비

1. 멸균 배양 튜브에서 잘 격리된 단일 콜로니를 3mL의 TSB를 접종하여 테스트할 박테리아 균주의 하룻밤 배양을 성장시킵니다. 37 ° C에서 225 rpm으로 흔들어 야간 배양 (16-24 시간)을 위해 배양하십시오 .
   메모: 균주는 2-4주마다 냉동고 재고에서 회수해야 하며 2주 이상 보관하지 않은 접시에 보관해야 합니다.

3. EPS 매트릭스 감지

참고: 이 무료 분석은 EPS를 정량화하고 시각화합니다. 두 경우 모두 다당류와 결합하기 위해 렉틴(lectin)을 사용하여 EPS를 검출합니다. 형광 접합 단백질은 정량화를 가능하게 합니다.

1. EPS의 반정량적 검출
   1. 2개의 1.5mL 튜브를 설정합니다. TSB 또는 TSB + BS가 있는 레이블.
   2. 각 튜브에 TSB 또는 TSB + BS 1mL를 추가합니다.
   3. 20μL의 야간 배양(1:50 희석)으로 튜브를 접종합니다.
   4. 바닥이 편평한 멸균 검은색 조직 배양 처리된 96웰 플레이트에서 130μL/웰의 무접종 대조군 배지를 3개의 웰에 추가하여 블랭크 대조군 역할을 합니다. 테스트할 각 매체 유형에 대해 3개의 제어 웰을 설정합니다. 130μL/웰의 접종된 배양액을 웰에 추가하고 모든 실험 조건이 3회 플레이팅될 때까지 반복합니다.
   5. 37 °C에서 4 - 24 시간 동안 정적으로 배양합니다.
   6. 배양 배지를 피펫을 사용하여 투명한 96-well 플레이트로 옮기며, 이상적으로는 멀티채널 피펫입니다. 플라스틱 표면에 위치한 부착 개체군 및/또는 EPS를 방해하지 않고 모든 배양 배지를 수집하도록 주의하십시오. 곁.
   7. 1x PBS에서 200μL/웰의 포름알데히드/글루타르알데히드를 사용하여 RT에서 15분 동안 블랙플레이트를 고정합니다.
   8. 부착 개체군이 고정되는 동안 1.1.6 단계의 상등액 분율을 평가합니다. 플레이트 리더를 사용하여 OD₆₀₀을 기록합니다. 컨트롤 웰을 '블랭크'로 설정합니다.제어 매체가 탁도의 증거 없이 깨끗한지 확인합니다. 탁도가 감지되면 실험을 폐기합니다.
      1. 또는 전체 분석을 검은색 투명 바닥 플레이트에서 수행할 수 있습니다. 이러한 상황에서, OD₆₀₀ 값은 기록될 수 있으며, 배양 배지는 단계 3.1.7로 진행하기 전에 이후에 폐기될 수 있다. OD₆₀₀ 값은 박테리아 균주 간의 성장률에 큰 차이가 있는 경우 데이터를 정규화하는 데 사용할 수 있습니다.
   9. 수정물을 제거하고 유해 폐기물에 버리십시오.
   10. 200μL/웰의 멸균 PBS로 웰을 두 번 부드럽게 세척합니다. 플레이트를 부드럽게 기울이고 웰 하단 가장자리에서 세척을 천천히 흡입하여 진공 라인을 사용하여 PBS 세척을 제거합니다.
   11. 150μL/well의 25μg/mL ConA-FITC를 추가하고 RT에서 15분 동안 배양합니다.
   12. 200μL의 PBS로 두 번 부드럽게 씻습니다.
   13. 각 웰에 150μL의 PBS를 추가합니다. 488nm에서 형광을 기록합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
트립틱 소이 브로스	시그마-알드리치	22092-500지
콘카나발린-A FITC	시그마	C7642-10mg
포도당	시그마	G7021-1KG
담즙 소금	시그마	B8756-100G
LB 한천	시그마	L7533-1KG
14 mL 배양 튜브, 17 x 100 mm, 플라스틱, sterile	어부	14-959-11B
Vectashield DAPI를 사용한 하드 세트 안티페이	벡터 연구소	H-1500
포름알데히드	시그마-알드리치	F1635-500
글루테알데히드	시그마-알드리치	G6257
바닥이 평평한 96웰 플레이트(투명)	증권 시세	92696
바닥이 평평한 96웰 플레이트(검은색)	Greiner 바이오 원	655076
바닥이 평평한 24웰 플레이트(투명)	증권 시세	92424
96웰 플레이트 리더	스펙트라맥스
형광판 판독기	바이오텍 시너지 2
컨포칼 또는 형광 현미경	Nikon A1 컨포칼 현미경
37°C 쉐이킹 인큐베이터	뉴브런즈윅 사이언티픽 엑셀라 E25
37°C 플레이트 인큐베이터	Thermolyne 시리즈 5000

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