Dispersion Assay를 통한 Biofilm 분해 검출

초록

출처: Nickerson, K. P. et. al., 장 병원체에서 담즙염 유도 생물막 형성: 식별 및 정량화 기술.J. Vis. 특급(2018년)

이 비디오는 다중 웰 플레이트를 사용한 생물막 분산 분석을 보여줍니다. 완충액과 포도당 처리는 생물막을 분해하여 박테리아를 방출하는 반면, 담즙염은 스트레스를 유발하여 박테리아를 보호하는 세포외 고분자 물질에 유지합니다. 완충액과 포도당을 사용한 더 높은 분산은 성공적인 생물막 분해를 확인하며, 이는 집락 형성 단위 측정으로 추정됩니다.

프로토콜

1. 시약의 준비

1. 담즙염 배지: 0.4% 담즙염(중량/부피)을 함유한 트립틱 대두 육수(TSB)를 준비하기 위해 50mL 오토클레이브 TSB에 담즙염 200mg을 재현탁합니다. 필터는 0.22μm 필터를 사용하여 멸균합니다. 매주 신선한 매체를 만드십시오 .
   노트: 일상적으로 사용되는 담즙염은 양과 소의 담낭에서 분리된 소듐 콜레이트와 소듐 데옥시콜레이트의 1:1 혼합물입니다. 앞서 설명한 바와 같이, 포도당의 존재는 담즙염 유도 생물막 형성에 필요했습니다. TSB는 Luria-Bertani(LB) 육수에 비해 포도당을 추가했습니다. 따라서 Shigella 및 분석된 다른 장 병원체에서 생물막 형성을 유도하기에 충분했습니다. 분석할 박테리아에 따라 다른 포도당 농도 또는 다른 설탕 요구량이 필요할 수 있습니다.
2. 0.5% w/v 크리스탈 바이올렛을 물에 넣으십시오: 크리스탈 바이올렛 2.5g을 500mL 증류수에 용해시킵니다. 필터는 0.22μm 필터를 사용하여 멸균합니다.
3. 인산염 완충 식염수(PBS) + 포도당: 포도당 0.2g을 10mL 1x PBS(최종 포도당 2% 포함)에 용해합니다. 필터는 0.22μm 필터를 사용하여 멸균합니다. 사용 당일에 신선하게 만드십시오.
4. PBS + 담즙염 : 10 mL 1x PBS (0.4 % w / v 담즙염 최종)에 40 mg을 용해시킵니다. 필터는 0.22μm 필터를 사용하여 멸균합니다. 사용 당일에 신선하게 만드십시오.
5. PBS + 포도당 및 담즙염: 40mg 담즙염과 0.2g의 포도당을 10mL 1x PBS(0.4% w/v 담즙염 및 2% w/v 포도당 최종)에 용해시킵니다. 필터는 0.22μm 필터를 사용하여 멸균합니다. 사용 당일에 신선하게 만드십시오.
6. LB 한천 플레이트를 준비합니다.

2. 박테리아의 준비

1. 멸균 배양 튜브에서 잘 격리된 단일 콜로니를 3mL의 TSB를 접종하여 테스트할 박테리아 균주의 하룻밤 배양을 성장시킵니다. 37 ° C에서 225 rpm으로 흔들어 밤새 배양 (16-24 시간)을 위해 배양합니다.
   메모: 균주는 2-4주마다 냉동실 재고에서 다시 줄무늬를 만들어야 하며 2주 이상 된 접시에 보관해야 합니다.

3. 분산 분석

참고: 이 분석에서는 박테리아 분산을 통한 생물막의 분해가 감지됩니다. 여기서, 성숙한 생물막이 형성되고 그 후(보통 다음날) 배지가 PBS 또는 보충된 PBS로 대체됩니다. 그런 다음 상등액 성분을 평가하여 생물막에서 해리된 박테리아의 수를 정

량화합니다.

1. 2개의 1.5mL 튜브를 설정합니다. TSB 또는 TSB + BS(담즙염)로 표시합니다.
2. 각 튜브에 TSB 또는 TSB + BS 1mL를 추가합니다.
3. 20μL의 야간 배양액으로 튜브를 접종합니다(1:50 희석).
4. 바닥이 편평한 멸균 투명, 조직 배양 처리된 96웰 플레이트에서 130μL/웰의 미접종 대조군 배지를 3개의 웰에 추가하여 블랭크 대조군 역할을 합니다. 테스트할 각 매체 유형에 대해 3개의 제어 웰을 설정합니다.
5. 130μL/웰의 접종된 배양액을 3개의 웰에 추가하고 모든 실험 조건이 3회 플레이팅될 때까지 반복합니다.
6. 플레이트를 37 °C에서 4 - 24 시간 동안 정적으로 배양합니다.
7. 계속하기 전에 PBS, PBS + 포도당, PBS + 담즙염 및 PBS + 담즙염 + 포도당을 37°C로 가열합니다.이 시약을 매일 신선하게 준비하십시오.
8. 플레이트 리더를 사용하여 광학 밀도 OD₆₀₀을 기록합니다. 컨트롤 웰을 'blank'로 설정합니다.매체가 탁도의 증거 없이 깨끗한지 확인합니다. 탁도가 감지되면 실험을 폐기합니다. OD₆₀₀ 값은 박테리아 균주 간에 성장률에 큰 차이가 있는 경우 데이터를 정규화하는 데 사용할 수 있습니다.
9. 진공 라인을 사용하여 배양 배지를 제거합니다. 플라스틱 표면에 위치한 부착 개체군을 방해하지 않고 모든 배양 배지를 수집해야 합니다.
10. 200μL/웰의 멸균 PBS로 웰을 두 번 부드럽게 세척합니다. 진공 라인을 사용하여 PBS 세척을 제거합니다.
11. 세척을 130μL/웰로 PBS, PBS + 포도당, PBS + 담즙염 및 PBS + 담즙염 + 포도당 각각 3개의 웰로 교체합니다. 이 시약은 37°C로 예열해야 합니다.
12. 플레이트를 30°C에서 37분 동안 배양합니다.
13. 37°C 인큐베이터에서 플레이트를 조심스럽게 제거합니다. 상층액을 신선하고 멸균된 96웰 플레이트로 옮깁니다.
14. 96웰 플레이트 또는 희석 블록을 사용하여 상층액을 10배(1:10) 연속 희석하여 멸균 PBS로 준비합니다.
    메모: 희석 시리즈는 테스트할 박테리아 균주에 따라 희석되지 않은 것부터 ^10-6까지 다양해야 합니다. 최적의 희석 범위를 결정하기 위해 파일럿 실험을 수행할 수 있습니다.
15. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 희석액의 5μL를 LB 한천에 스팟 플레이트합니다. 37 °C에서 밤새 배양합니다. 다음 날에 콜로니를 세고 회수 콜로니 형성 단위(CFU)를 결정할 때 희석 계수를 고려합니다. 1x PBS 대조군(100%로 설정)에 대한 백분율 분산을 계산하려면 각 처리 조건의 회수 CFU를 1x PBS 대조군 샘플의 회수 CFU로 나눕니다.
    메모: 관심 박테리아 균주에 대한 일상적인 배지 플레이트도 사용할 수 있습니다. 예를 들어, Shigella는 콩고 레드 플레이트에 도금될 수 있습니다. 적절한 스폿 도금 기술을 위해 플레이트가 건조한지 확인하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
트립틱 소이 브로스	시그마-알드리치	22092-500지
포도당	시그마	G7021-1KG
담즙 소금	시그마	B8756-100G
LB 한천	시그마	L7533-1KG
14 mL 배양 튜브, 17 x 100 mm, 플라스틱, sterile	어부	14-959-11B
바닥이 평평한 96웰 플레이트(투명)	증권 시세	92696
96웰 플레이트 리더	스펙트라맥스
형광판 판독기	바이오텍 시너지 2
37°C 쉐이킹 인큐베이터	뉴브런즈윅 사이언티픽 엑셀라 E25
37°C 플레이트 인큐베이터	Thermolyne 시리즈 5000

표시기 년