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1. 곰팡이 군집에서의 박테리아의 체외 생물막 준비
- 박테리아 배양액을 5,000 x g에서 3분 동안 원심분리하고 25ml의 멸균 0.1M 인산칼륨 완충액(25g/L KH2PO4 및 2.78 g/L K2HPO4, pH 5.8)에 펠릿을 현탁시킵니다. 이 단계를 한 번 반복하고 동일한 버퍼로 최종 박테리아 농도를 109 cells/ml로 조정합니다.
- 6웰 마이크로플레이트에 5ml의 박테리아 현탁액(또는 음성 대조군의 경우 멸균 0.1M 인산칼륨 완충액)을 채웁니다.
- 멸균 면도날로 곰팡이 배양의 셀로판 막을 절단하여 각 막에 단일 곰팡이 군집이 있는 셀로판 사각형을 얻습니다. 겸자를 사용하여 고체 매체에서 균사를 포함하는 셀로판 사각형을 조심스럽게 제거하고 균사를 포함하는 셀로판 사각형을 박테리아 현탁액을 포함하는 마이크로플레이트의 웰로 옮깁니다.
- 곰팡이 군집이 셀로판지에 붙어 있는 동안 마이크로플레이트를 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 셀로판 시트를 제거하고 판에 곰팡이 군집을 남겨둡니다.
- 연구된 미생물에 적합한 온도에서 부드러운 교반(~60rpm)으로 마이크로플레이트를 배양합니다.
메모: 배양 시간은 생물막의 형성 속도와 분석 할 단계에 따라 다릅니다. P. fluorescens BBc6/L. bicolor의 경우 20°C에서 30분 동안 배양하면 초기 단계의 생물막을 얻을 수 있고 최대 16시간 동안 배양하면 성숙한 생물막을 얻을 수 있습니다.
2. 생물막 형성의 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경 분석
- 시료 전처리
- 플랑크톤 박테리아와 균사에 정전기로 부착된 박테리아를 제거하려면 곰팡이를 5ml의 강한 소금 용액(NaCl, 17g/L)으로 채워진 새로운 6웰 마이크로플레이트에 옮겨 곰팡이를 헹굽니다. 1분 동안 부드럽게 흔듭니다.
- 곰팡이를 5ml의 멸균 0.1M 인산칼륨 완충액이 들어 있는 새로운 6웰 마이크로플레이트로 옮기고 2분 동안 부드럽게 흔든 다음 곰팡이를 신선한 인산칼륨 완충액으로 옮깁니다.
- 인산칼륨 완충액에 보관하면서 메스로 이미지화할 곰팡이 군집의 일부를 잘라내고, 얻은 부분에 곰팡이 군집의 약 절반이 포함되도록 합니다.
- 샘플을 염색하려면 적절한 형광 염료가 함유된 멸균수(분석 목적에 따라 다름)로 채워진 페트리 접시에 옮기고 어두운 곳에서 배양합니다.
- 곰팡이 네트워크를 시각화하기 위해 예를 들어 Congo Red(0.1% 최종 농도, 5분 배양), Alexa Fluor 633(10μg/ml 최종 농도, 10분 배양) 또는 FUN1(10μM 최종 농도, 10분 배양 10분)에 접합된 밀 배아 응집소(WGA) 렉틴을 사용합니다.
- 형광성 태그가 지정되지 않은 박테리아를 사용하는 경우, 시판되고 있는 수많은 세포 투과 DNA 염료 중 DNA 특이적 형광 프로브로 박테리아 세포를 대조염색합니다. 예를 들어, DAPI(0.25μg/ml 최종 농도, 10분 배양)를 사용합니다.
- 매트릭스 단백질을 시각화하려면 단백질 염색을 사용합니다.
- 염색 후 10ml의 멸균 0.1M 인산칼륨이 들어 있는 페트리 접시 뚜껑에 샘플을 옮겨 헹구고 1분 동안 부드럽게 흔듭니다.
- 페트리 접시 뚜껑에 슬라이드를 반쯤 담그고 절단 부분을 슬라이드 위로 조심스럽게 띄웁니다. 그런 다음 버퍼 용액에서 슬라이드를 천천히 제거하여 샘플이 슬라이드에 부드럽게 가라앉도록 합니다.
메모: 이 단계에서는 생물막 교란을 피하기 위해 부드럽게 진행하는 것이 매우 중요합니다.
- 마지막으로, 10μl의 변색 방지 장착 매체를 샘플에 추가하고 유리 커버슬립으로 덮습니다.
메모: 슬라이드가 준비되면 생물막 구조의 변형을 방지하기 위해 가능한 한 빨리(최대 30분 이내) 현미경 분석을 수행해야 합니다.