컨포칼 현미경을 사용한 다양한 종양 영역에서의 상주 T 세포 이동에 대한 실시간 분석

초록

출처: Peranzoni, Elisa, et al. 컨포칼 현미경을 사용한 인간 폐 종양 절편에 상주하는 CD8 T 림프구의 ex vivo 이미징. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 인간 폐 종양 절편 내에서 형광 결합 항체로 표지된 상주 종양 침투 CD8 T 세포의 이미징을 설명합니다. 이 기술을 사용하면 컨포칼 현미경을 사용하여 CD8 T 세포 이동을 실시간으로 분석할 수 있습니다.

프로토콜

1. 상주 CD8 T 세포 및 종양 세포의 면역 염색

1. 항체(최종 농도 10μg/mL)와 핵 염료(최종 농도 1μg/mL)를 페놀 레드가 없는 RPMI-1640 배지에 희석합니다.
   메모: 형광 결합 항-CD8(쥐 IgG, 클론 SK1) 및 항-EpCAM(상피 세포 접착 분자)(쥐 IgG HEA-125) 항체를 사용하여 CD8 T 림프구 및 종양 상피 세포를 각각 라벨링합니다. 형광 결합 항-CD90/Thy1(쥐 IgG, 클론 5E10) 항체를 사용하여 섬유아세포 및 활성화된 내피 세포를 라벨링합니다. 조직 생존력을 평가하기 위해 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)을 사용하여 손상된 원형질막이 있는 세포핵을 라벨링합니다.
2. 인큐베이터에서 배양 플레이트를 제거하고 피펫을 사용하여 스테인리스 스틸 와셔 내부의 액체를 흡입합니다. 세포 배양 삽입물 아래에 놓인 1.1mL RPMI-1640 배지를 제거하지 마십시오.
3. 절편을 건드리지 않고 피펫 팁을 사용하여 항체가 포함된 용액 40μL를 각 종양 절편에 추가합니다.
4. 항체 염색을 허용하기 위해 37 °C에서 15 분 동안 플레이트를 배양합니다.
5. 가는 집게로 와셔를 제거하고 조각을 꺼낸 다음 페놀 레드가 없는 RPMI-1640 매체에 10초 동안 담급니다. 슬라이스를 세포 배양 삽입물에 다시 놓고 각 개별 슬라이스에 페놀 레드가 없는 RPMI-1640 배지 한 방울을 추가합니다. 플레이트를 37분 동안 10°C로 유지합니다. 이미징을 진행합니다.

2. 인간 폐 종양 절편 내 상주 CD8 T 세포 이동 이미징 및 분석

참고: 이 프로토콜에 사용된 컨포칼 현미경은 25x 침수 대물렌즈(25x/0.95 N.A.)가 장착된 직립 회전 디스크입니다.

1. 현미경 설정 준비
   1. 이미징 세션을 시작하기 몇 시간 전에 현미경 열 챔버의 온도를 37°C로 설정하십시오.
   2. 산소화된(5% CO₂, 95% O₂) 페놀 레드가 없는 RPMI 배지로 종양 절편을 지속적으로 관류하도록 시스템을 설정합니다(그림 1). 연동 펌프를 사용하여 관류 매체를 이미징 챔버로 흐르게 하고 용액을 폐기물 수집 플라스크로 흡입합니다.
   3. 연동 펌프를 작동하여 산소가 공급된 용액이 관류 튜브를 통과할 수 있도록 합니다.
2. 가는 집게를 사용하여 6웰 플레이트에서 슬라이스를 꺼내 페놀 레드가 없는 RPMI 배지로 채워진 35mm 플라스틱 접시에 옮깁니다. 2mm 간격의 나사산이 있는 19.7mm 직경의 슬라이스 앵커로 슬라이스를 고정합니다. 이미징 스테이지에 페트리 접시를 놓습니다.tag현미경의 e. 관류 시스템의 입구와 출구 팁을 연결합니다. 관류 시스템을 켜고 매체 유속을 0.8mL/분으로 설정합니다.
3. 물 담그기 대물렌즈를 슬라이스로 내립니다. 명시야 조명이 있는 슬라이스의 맨 위에 초점을 맞춥니다. 적절한 형광등을 사용하여 CD8 T 세포, 종양섬(EpCAM에 양성) 및 기질 영역(CD90에 양성)이 포함된 관심 영역을 선택합니다. 절단면과 조직 깊숙한 곳에서 DAPI 염색을 평가하여 슬라이스 내 세포의 생존 가능성을 확인합니다.
   참고: 건강한 슬라이스는 절단 표면에서 수 미크론에 소수의 DAPI 양성 세포만 포함합니다.
4. 다음 작업으로 이미징 세션을 설정합니다.
   1. 3개의 형광단의 형광 신호의 강도에 따라 노출 시간을 50에서 800ms 사이로, 레이저 강도를 20에서 40% 사이로 설정합니다.
   2. 종양 slice.
      내에서 이미지화할 z 스택 두께를 선택합니다. 메모: 여기에서 z 차원에서 총 60-70μm 깊이에 걸쳐 있는 10-12개의 광학 평면이 캡처되었습니다.
   3. 첫 번째 라벨링된 CD8 T 세포에서 약 10μm 아래의 시작 위치를 선택합니다.
   4. 각 z-stack 이미지 사이의 시간 간격을 10초에서 30초 사이로 정의하고 총 녹화 시간을 10분에서 30분 사이로 정의합니다.

결과

그림 1: 관류 시스템의 사진. A) 페놀 레드가없는 RPMI 용액은 5 % CO₂, 95 % O₂가 풍부합니다. B) 그런 다음 용액을 연동 펌프에 의해 관류합니다. C) RPMI 용액은 주입구를 통해 배양 접시로 들어갑니다. 출구에서 용액은 챔버에서 폐기물 용기로 펌프에 의해 흡입됩니다. 흡인 팁은 솔루션 높이를 결정하기 위해 레벨로 설정됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
정립 컨포칼 현미경	라이카	스피닝 디스크 컨포칼을 사용하는 것이 좋습니다.
이마리스 소프트웨어	비트플레인		이 소프트웨어는 이미지의 시각화 및 T 세포 이동의 추적에 사용됩니다
가는 집게	세계적인 정밀 기기	14142
30mm 배양 인서트	밀리포어	PICM0RG50
Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 배지, GlutaMAX 보충제	써모피셔	61870010	완전한 RPMI-medium은 10% 열 비활성화 태아 송아지 혈청과 페니실린/스트렙토마이신을 첨가하여 만들어집니다
인산염 완충 식염수(PBS)	써모피셔	20012019
행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)	인비트로젠	14170088
낮은 겔화 온도: 아가로스, VII-A 타입	시그마-알드리치	A0701
무독성 부틸 시아노아크릴레이트 접착제, Vetbond	3엠	1469
슬라이스 앵커, 직경 19.7mm, 2mm 간격 나사산	워너 인스트루먼트	64-1415
스테인리스강 와셔, 내경 5mm	아마존	B004K1FDGQ
BV605-conjugated anti-CD8 (클론 SK1)	BD 바이오사이언스	565289
FITC-conjugated anti-EpCAM (클론 HEA-125)	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-098-113
BV510-conjugated anti-CD90 (클론 5E10)	바이오레전드	328125
4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI	써모피셔	D1306 (영어

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