참고: 이 프로토콜은 마우스 생물학적 샘플에서 파종 활성을 검출하기 위해 FRET 유세포 분석의 사용을 강조합니다. 또한 재조합 원섬유 및 인간 생물학적 샘플과도 호환됩니다. 마우스 안락사 및 뇌 적출은 IACUC가 승인한 절차에 따라 수행되었습니다.
1. 뇌 추출
- 이소플루란(2%)으로 심층 마취한 후 0.03% 헤파린을 함유한 얼음처럼 차가운 PBS로 마우스를 관류하고 Gage 등에 설명된 세부 사항에 따라 뇌를 추출합니다.
- 추출한 조직을 cryo-vial에 넣고 액체 질소에 넣어 급속 동결합니다. 또는 드라이 아이스에 조직을 얼립니다. 일단 얼면 조직을 -80 °C로 옮기고 필요한 경우 장기간 보관하십시오.
메모: 이 프로토콜은 전체 뇌 균질화 또는 미세 절개 된 뇌 영역과 호환됩니다. Hagihara et al. 참조.자세한 미세해부 프로토콜.
2. 생물학적 종자 물질의 준비
- 프로테아제 억제제(에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 무함유))를 1x TBS(트리스 완충 식염수, 10ml당 1정)에 용해시켜 균질화 완충액을 준비합니다. 격렬하게 소용돌이치고 얼음 위에 보관하십시오. 프로테아제 억제제는 바이오센서 세포 생존력을 보존하기 위해 EDTA가 없어야 합니다.
- 일회용 계량 보트에서 얼어붙은 뇌 조직의 무게를 측정하고 5ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 얼음-차가운 균질화 완충액을 추가하여 최종 용액이 10% 중량/부피가 되도록 합니다. 임시로 얼음에 보관하십시오. 조직 질량과 그에 따른 균질화 완충액 부피는 사용되는 뇌 크기 및/또는 영역에 따라 달라집니다. 여기서, 무게가 0.2g인 성체 마우스 반뇌를 10% w/vol 용액을 위해 2ml에 현탁합니다.
- 샘플을 냉장실로 옮기고 프로브 초음파 처리기를 적절한 설정으로 조정합니다. Omni Ruptor(여기에 표시됨)를 사용한 프로브 초음파 처리의 경우 전력을 약 75W에 해당하는 20%로 설정합니다. 펄스 모드를 사용하여 초음파 처리 중에 샘플이 과열되지 않도록 합니다. 펄서를 약 500msec에 해당하는 30%로 설정합니다.
- 물, 이소프로판올, 물로 헹구고 다시 물로 헹구고 각 용액 사이에 있는 프로브를 닦아내어 프로브 초음파 처리기의 끝을 청소합니다. 실험실용 물티슈로 프로브의 양쪽 측면과 바닥을 모두 헹구고 닦으십시오.
- 한 번에 하나의 샘플로 작업하면서 프로브 팁을 균질화 버퍼에 담그고 초음파 처리기를 시작합니다. 위에서 설명한 전력 및 펄서 설정을 사용하여 총 25개의 펄스를 전달합니다. 조직이 완전히 현탁 상태인지 확인하십시오. 이 단계에서 샘플에 거품이 생기지 않도록 주의하십시오.
메모: 샘플은 a) 총 부피가 낮거나 b) 균질화가 예열되는 경우 거품이 발생하기 쉽습니다. 이 특정 기기를 사용하면 250 μl 미만의 부피로 초음파 처리하지 마십시오. 샘플이 차갑게 유지되도록 이 단계에서 튜브를 얼음 위에 보관할 수 있습니다.
- 잔류 용해물을 닦아내어 프로브를 청소한 다음 깨끗한 물이 담긴 비커에 10펄스를 전달합니다. 프로브의 측면과 바닥을 물, 이소프로판올, 물로 다시 헹구고(2.4단계와 같이) 각 단계 사이에 물기를 닦아냅니다. 오염을 방지하려면 샘플 사이에서 프로브를 철저히 헹굽니다.
메모: 타우 응집체의 경우, 시료 간 오염을 방지하기 위해 보다 엄격한 세척 방법이 필요하다는 것을 발견하지 못했습니다. 그러나 다른 아밀로이드는 추가 치료가 필요할 수 있으며, 이는 문헌에 광범위하게 설명되어 있습니다.
- 모든 샘플이 처리될 때까지 균질액을 얼음에 보관하십시오.
- 스핀은 21,300 x g에서 4 °C에서 15 분 동안 균질화합니다.
- 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 상등액을 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 펠릿을 버리십시오. 상층액을 분취하고 추가 사용을 위해 -80 °C에서 용해물을 보관하십시오. 그러나 균질액의 동결/해동 주기는 파종 효율을 감소시키므로 피하십시오.
3. 바이오센서 셀 리플레팅
참고: 이 분석에는 HEK 293T(세포주 #1), RD-P301S-CFP(세포주 #2), RD-P301S-YFP(세포주 #3) 및 RD-P301S-CFP/YFP(세포주 #4)의 4개 세포주를 사용합니다. 분석에 대한 각 세포주의 기여도에 대해서는 참고 표 1을 참조하십시오.
- 무균 환경에서는 배양 배지를 흡입하십시오. 따뜻한 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 헹구고 흡인합니다. 세포(트립신-EDTA 3ml(0.05%))를 3분 동안 트립신화하고 따뜻한 배양 배지(DMEM 9ml, 소 태아 혈청(FBS) 10%, 페니실린/스트렙토마이신, 글루타맥스 1%)로 담금질한 후 즉시 세포를 원뿔형 튜브로 이동합니다.
- RT에서 5분 동안 1,000 x g에서 세포를 원심분리합니다.배지를 흡인하고 따뜻한 배양 배지에서 세포 펠렛을 재현탁합니다.
- 혈구계를 사용하여 각 세포주에 대한 세포 밀도를 측정합니다. 세포 밀도는 수확 시점의 포화도와 재현탁 부피에 따라 달라집니다. 10cm 접시에서 수확한 세포를 10ml 배지의 90% 포화도로 재현탁하여 세포 밀도가 약 100만 cells/ml가 되도록 합니다.
- 96웰 플레이트의 각 웰에 130μl 배지에 35,000개의 세포가 포함되도록 세포 + 배지의 마스터 믹스를 만듭니다(예: 100웰에 대한 마스터 믹스를 만들려면 13ml 배지에 350만 개의 세포를 재현탁). 개별 실험 설계 및 타임라인에 맞게 세포 수를 수정합니다. 도금 후 ~18시간 후 세포 처리의 경우 96웰 플레이트의 각 웰에 35,000개의 세포를 추가합니다.
- 멀티 채널 피펫을 사용하여 130μl의 마스터 믹스 세포 현탁액을 평평한 바닥, 조직 배양 처리된 96웰 플레이트의 각 웰에 천천히 피펫팅합니다. 도금하는 동안 피펫 끝을 플레이트 바닥에 닿지 않도록 웰 중앙에 놓습니다.
메모: 도금 형식을 변경할 수 있지만 플레이트당 1-3개의 세포주 각각에 대해 n = 4웰을 만드는 것이 좋습니다. 플레이트의 나머지 부분(n = 84)은 세포주 #4(바이오센서 세포)를 위해 예약되어 있습니다.
- RT에서 10분 동안 플레이트를 방해받지 않고 그대로 두어 세포가 정착할 수 있도록 합니다. O/N을 37°C, 5% CO2 및 ≥80% 상대 습도에서 배양합니다.
4. 세포 치료
참고: 다음 날, 타우 바이오센서 세포가 60-65% 융합되면 다음과 같이 종자 형질도입 복합체를 준비합니다.
- 하나의 튜브에서 Lipofectamine과 같은 transfection 시약과 Opti-MEM과 같은 환원된 혈청 배지를 결합하여 마스터 믹스를 만들 수 있습니다. 웰당 1.25μl transfection 시약과 8.75μl 감소 혈청 배지를 추가합니다. 튜브를 부드럽게 튕겨 섞고, 잠시 스핀다운한 다음 RT에서 5분 동안 배양합니다.
- 다른 튜브에서 종자 물질(2.9단계의 용해물 분취량)과 감소된 혈청 배지를 결합합니다.
메모: 종자 물질의 부피는 개별 실험에 따라 다릅니다. 종자 부피를 선택할 때 샘플에 종자가 풍부하고 잠재적 독성이 있는지 고려하십시오. 미처리 균질액은 세포에 독성이 있을 수 있습니다. 따라서 가능한 가장 낮은 볼륨을 사용하여 원하는 효과를 모니터링하십시오. 이전에 테스트된 용해물/웰 부피는 1-5 μl이며, 이는 총 단백질 5-20 μg에 해당합니다. 웰당 총 부피(종자 + 감소된 혈청 배지)가 10μl인지 확인합니다.
- 4.1 및 4.2에 설명된 두 튜브의 내용물을 결합하고, 부드럽게 튕겨 섞고, 짧게 회전시키고(1,000 x g, 5초), 최소 20분에서 최대 2시간 동안 RT에서 배양합니다.
- 20 μl의 transduction complex를 개별 바이오센서 웰 측면에 부드럽게 피펫팅합니다. 가능하면 세 가지 기술 반복을 사용합니다. 처리된 세포를 24-48시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 3.6.
단계에서 설명한 것과 동일한 조건에서 배양합니다.
메모: 이 설정에 대한 적절한 음성 대조 조건은 빈 리포좀(즉, 리포좀 시약 + 저혈청 배지)으로 처리된 바이오센서 세포인데, 이는 인지질을 적용하면 리포좀 시약에 노출되지 않은 바이오센서 세포에 비해 형광 프로파일에 약간의 변화가 발생하기 때문입니다.
5. FRET 유세포 분석을 위한 세포 수확
참고: 세포를 수확하기 전에(일반적으로 처리 후 24-48시간) 표준 도립 형광 현미경에서 녹색 형광 단백질(GFP) 필터를 사용하여 파종 활성에 대한 예비 판독값을 얻을 수 있습니다. 종자 물질 없이 처리된 세포(즉, 빈 리포좀)는 확산 형광을 보이는 반면, 종자 물질로 처리된 세포는 강렬한 반점 및 망상 세포 내 개재물을 나타냅니다(그림 1A-B).
- 다중 채널 피펫을 사용하여 모든 세포 배지(150μl)를 흡인합니다. 5분 동안 세포를 트립신화(50μl)하고 150μl 냉각 배양 배지로 퀀칭합니다. 이 단계에서 트립신화 전에 PBS 헹굼을 포함하면 세포 융상 및 후속 세포 손실이 발생할 수 있으므로 포함하지 마십시오. 게이팅 전략을 통해 유세포 분석 중 오염된 사멸 세포와 파편을 제외합니다.
- 담금질 직후 세포를 96웰 원형 바닥 플레이트로 옮기고 RT에서 5분 동안 1,000 x g에서 원심분리합니다.
- 배지를 흡인 및 폐기하고 세포 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.
- 부드럽지만 철저하게 세포 펠릿을 50μl 2% 파라포름알데히드에 재현탁하고 10분 동안 배양합니다. 또는 세포를 살아서 실행하지만 고정이 더 깨끗하고 일관된 결과를 제공합니다.
- RT에서 5분 동안 1,000 x g의 세포를 원심분리합니다. 파라포름알데히드를 흡인하고 버리고 세포 펠릿을 방해하지 않도록 주의합니다.
- 부드럽지만 철저하게 세포 펠릿을 200μl 냉각 유세포 분석 완충액(Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS), 1% FBS, 1mM EDTA)에 재현탁하고 세포 응집을 방지하기 위해 가능한 한 빨리 플레이트를 실행합니다.
6. FRET 유세포 분석
참고: FRET 호환 레이저 라인과 필터 세트가 장착된 MACSQuant VYB와 같은 유세포 분석기를 사용하십시오(표 2). 이 섹션의 각 단계에 대해 소프트웨어의 96 웰 템플릿을 사용하여 관심 있는 웰을 클릭하고 "재생"을 클릭하여 샘플 흡수 및 흐름을 시작합니다. '새 분석 창' 아이콘을 클릭하여 플롯 또는 통계 테이블을 만듭니다. 개별 이변량 플롯에서 축 파라미터를 변경하려면 X 또는 Y축에서 제목을 클릭하고 적절한 필터를 선택합니다. 세포 집단 또는 형광 신호를 이동하려면 적절한 필터와 관련된 전압을 높이거나 낮춥니다. 이 기기를 사용하면 초당 <1,000개의 이벤트를 실행하여 정확한 단일 세포 모니터링을 보장할 수 있습니다.
- 측면 산란 영역(SSC-A) 대 전방 산란 영역(FSC-A) 이변량 플롯을 만들고 세포주 #1이 실행 중인 상태에서 세포 모집단이 왼쪽 하단 사분면에 올 때까지 SSC 및 FSC 전압을 조정합니다. 폴리곤 도구를 클릭하고 셀 모집단(Gate P1)을 정의합니다. 모든 게이팅 매개변수는 그림 2를 참조하십시오.
- FSC-H(높이) 대 FSC-A 이변량 플롯을 만들고 플롯 위의 "라이브"를 클릭하고 P1을 선택하여 이 플롯에 게이트 P1을 적용합니다. 셀선 #1이 실행 중인 상태에서 폴리곤 도구를 클릭하고 단일 셀(게이트 P2)을 정의합니다.
- 관심 있는 필터(CFP, YFP, FRET) 각각에 대해 하나씩 3개의 히스토그램 플롯을 만듭니다. 플롯 위의 "라이브"를 클릭하고 P2를 선택하여 이러한 모든 플롯에 게이트 P2를 적용합니다. cell line #1이 실행 중인 상태에서 CFP, YFP 및 FRET 히스토그램의 cell population 중앙값이 모두 0과 1 사이가 되도록 전압을 조정합니다. CFP 및 FRET를 측정하려면 405nm 레이저로 세포를 여기하고 각각 450/50nm 및 525/50nm 필터로 형광을 캡처합니다. YFP를 측정하려면 488nm 레이저로 세포를 여기하고 525/50nm 필터로 형광을 캡처합니다. 레이저 및 필터 설정은 표 2에 자세히 설명되어 있습니다.
- FRET 및 YFP 채널로의 CFP 스필오버에 대한 보상을 수행합니다.
메모: 보상(Compensation)은 형광 스필오버 보정(spillover correction)의 과정입니다. 형광 스필오버(Fluorescence spillover)는 한 형광 색소의 형광 방출이 다른 형광 색소의 신호를 측정하도록 설계된 필터 내에서 감지될 때마다 발생합니다. 적절한 보상을 통해 FRET 및 YFP 채널에서 CFP 스필오버 형광을 제거할 수 있습니다.
메모: 보상은 형광 -positive 및 -negative 세포가 모두 존재해야 합니다. 따라서 CFP 양성 세포(세포주 #2)를 보상하려면 실행 전에 음성 세포(세포주 #1)를 샘플에 추가해야 합니다.
- 보상 직전에 단일 웰에서 30μl의 세포주 #1 현탁액을 200μl의 세포주 #2 현탁액으로 스파이크합니다.
- "Instrument Settings" 아이콘을 클릭한 다음 'compensation' 탭을 클릭하고 'matrix'를 선택하여 보상 테이블을 엽니다.
- FRET-A 대 CFP-A 이변량 플롯을 만들고 6.3단계에 설명된 대로 게이트 P2를 적용합니다. 세포주가 1+2 실행 중인 상태에서 '사분면' 아이콘을 클릭하고 형광 -음성 및 -양성 집단이 아래쪽 두 사분면(각각 Gates LL3 및 LR3)으로 분리되도록 사분면을 그립니다.
- LL3 및 LR3 게이트에 대한 FRET의 MFI(Median Fluorescence Intensity)를 표시하는 통계 테이블을 만듭니다. FRET 신호의 MFI가 LL3과 LR3 사이에서 동일해질 때까지 보상 매트릭스에서 FRET 매개변수를 조정합니다. 이 단계에 따라 FRET 신호의 MFI는 염색되지 않은 세포와 CFP 양성 세포 간에 동일하며, 이는 FRET 채널로의 CFP 스필오버가 없음을 시사합니다.
- YFP-A 대 CFP-A 이변량 플롯을 만들고 6.3단계에 설명된 대로 게이트 P2를 적용합니다. 6.4.3단계에서 수행한 것과 유사한 사분면(LL4 및 LR4)을 그립니다.
- LL4 및 LR4에 대한 YFP의 MFI를 표시하는 통계 테이블을 만듭니다. YFP 신호의 MFI가 LL4와 LR4 사이에서 동일해질 때까지 보상 매트릭스에서 YFP 매개변수를 조정합니다. 이 단계에 따라 YFP 신호의 MFI는 염색되지 않은 세포와 CFP 양성 세포 간에 동일하며, 이는 YFP 채널로의 CFP 파급이 없음을 시사합니다.
- 게이트 설정 및 보정 후 관심 있는 웰을 강조 표시하고 플레이트의 나머지 부분을 실행합니다.
- 모든 샘플이 실행된 후 '파일'을 클릭한 다음 '복사'를 클릭하여 데이터 파일을 내보냅니다. '데이터 파일' 탭을 선택하고 실험 폴더를 강조 표시한 다음 '복사'를 클릭합니다.
