포유류 세포에서 재조합 항체의 생산 및 정제

초록

출처: Shivange, Gururaj, et al. 표적 항원 특이적 치료 항체의 종양 및 조직 분포 분석. J. Vis. 특급.(2020).

이 비디오는 유전자 발현에서 분비에 이르기까지 포유류 숙주 세포에서 항체를 생산하는 과정을 설명합니다. 여기에는 전사, 번역, 신호 인식, 올바른 접힘, 그리고 궁극적으로 분비 소포를 통해 세포 외 매체로 방출되는 것이 포함됩니다.

프로토콜

1. 항체의 발현 및 정제

1. CHO 세포의 유지
   1. 유리 또는 일회용의 delong 삼각 플라스크를 사용하여 37°C에서 130rpm에서 5% CO₂로 진탕하는 시판되는 1x 글루타민 보충제가 보충된 FreeStyle CHO Media에서 CHO 세포를 성장시킵니다.
      메모: 교반을 증가시키고 흔들리는 조건에서 가스 전달을 개선하기 위해 통풍 캡이 있는 배플 플라스크를 사용하는 것이 좋습니다. 현저하게 감소된 항체 수율은 현탁액 배양의 제한된 교반으로 인해 일반 플라스크(non-baffled)에서 얻어졌습니다.
   2. >95%의 세포 생존율로 1-5 x 10⁶ cells/mL 사이의 세포 수를 유지합니다. 세포 수가 5 x 10⁶ cells/mL 이상으로 증가하면 세포를 분할합니다. CHO 세포가 0.2 x 10⁶ cells/mL 미만에 도달하지 않도록 하십시오.
2. CHO 세포의 transfection
   1. delong Erlenmeyer baffled flasks.
      에서 200mL의 배지(2 x 10,⁶ cells/mL)에서 CHO 세포를 성장시킵니다. 메모: 배플 플라스크에서 성장한 현탁 배양은 배플이 없는 플라스크에서 성장할 때보다 항상 더 높은 단백질 수율을 생성했습니다.
   2. 15mL 튜브에 CHO FreeStyle 배지 5mL를 취하고 VH 클론 DNA 50μg과 VL 클론 DNA 75μg을 추가합니다. 소용돌이가 잘 섞입니다.
   3. DNA 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다.
      메모: 배양 시간이 길어지면 단백질 수율이 감소합니다.
   4. DNA 용액에 750μL의 1mg/mL 폴리에틸렌이민(PEI) 스톡을 추가하고 30초 동안 혼합물을 공격적으로 와류로 배>합니다. 실온에서 추가로 5분 동안 배양합니다
      메모: PEI는 신선하게 만들어져야 합니다. PEI의 다중 동결 해동 주기는 전체 수율을 크게 감소시킵니다.
   5. DNA와 PEI의 전체 혼합물을 세포에 첨가하면서 플라스크를 수동으로 흔듭니다. 즉시 delong Erlenmeyer 당황한 플라스크를 37°C에서 130rpm으로 진탕한 세포로 배양합니다.
3. 표현식
   참고: 항체는 N-말단 말단에 조작된 분비 신호 펩타이드를 가지고 있어 항체가 배지로 분비되는 데 도움이 됩니다.
   1. transfection된 세포를 37°C에서 성장시키고 1일차에 130rpm으로 진탕합니다.
   2. 2일차에 100x 항응집제 2mL와 100x 항균 항진균 용액 2mL를 추가합니다. 플라스크를 더 낮은 온도(32-34°C)로 옮기고 130rpm으로 흔듭니다.
   3. 5일마다 10mL의 트립톤 N1 사료와 2mL의 100x 글루타민 보충제를 추가합니다.
   4. 트리판 블루 염색으로 세포 분취액을 염색한 후 혈구계를 사용하여 3일에 한 번씩 세포를 계속 계수합니다. 세포 생존율이 80% 이상으로 유지되는지 확인합니다.
   5. 10일 또는 11일째에 항체 정제를 위해 배지를 수확합니다. 3000 x g, 4 °C에서 40-60 분 동안 배양물을 회전 한 다음 0.22 μM 병 필터를 사용하여 투명 매체를 여과합니다.
4. 정화
   메모: 항체 정제는 연동 펌프를 사용하여 시판되는 Protein-A 컬럼(재료 표 참조)을 사용하여 수행됩니다.
   1. 2열 부피의 결합 완충액(pH 7.4에서 20mM 인산나트륨)으로 컬럼을 평형화합니다.
   2. 항체가 포함된 여과된 배지(1.3.5단계에서 획득)를 1mL/분의 유속으로 컬럼에 통과시킵니다.
   3. 2열 부피의 결합 버퍼로 컬럼을 세척합니다.
   4. 5mL 용출 완충액(pH 3.4에서 30mM 소듐 아세테이트)을 사용하여 항체를 500μL 분획으로 용리합니다.
   5. 분획당 10μL의 중화 완충액(pH 9에서 3M 아세트산 나트륨)을 추가하여 용출된 항체의 pH를 중화합니다
      메모: 분수 3-6은 대부분의 항체를 포함합니다. 항체가 예상보다 늦은 분획에서 용리되는 경우를 대비하여 모든 분획을 유지하는 것이 좋습니다.
   6. 분광광도계를 사용하여 IgG에 대한 기본 프로토콜을 선택하여 정제된 항체의 농도를 측정합니다. 항체의 최종 농도는 분자량과 흡수 계수를 고려하여 mg/mL 단위로 구합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
FreeStyle CHO 미디어	Gibco Life 기술	고양이 # 12651-014
안티 (100X)	Gibco Life 기술	고양이 # 15240-062
Anti-Clumping Agent (안티 응집제)	Gibco Life 기술	고양이 # 01-0057DG
BD 인슐린 주사기	BD 바이오사이언스	고양이 #329420
캘리퍼 IVIS 스펙트럼	퍼킨엘머	고양이 #124262
CHO CD 이피션트피드 B	Gibco Life 기술	고양이 #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium)	코 닝	고양이 # 10-13-CV
코닝 500 mL RPMI 1640	코 닝	고양이 # 10-040-CV
Cy5 활용 항인간 IgG (H+L)	잭슨 이뮤노리서치	고양이 # 709-175-149
글루타맥스-I (100X)	Gibco Life 기술	고양이 # 35050-061
HiPure 플라스미드 Maxiprep 키트	인비트로젠	고양이 # K21007
HiTrap MabSelect SuRe 컬럼	GE 헬스케어	고양이 # 11-0034-93
이소플루란, USP	코브트러스	고양이 # 11695-6777-2
윤활제 눈 연고	Lacri-Lube 새로 고침	고양이 #4089
PEI 트랜스펙션 시약	써모 피셔	고양이 # BMS1003A
실험 모델: 세포주
인간: OVCAR-3	아메리칸 타입 컬처 컬렉션	ATCC HTB-161
인간: CHO-K 세포	실험실에서 안정적으로 변화	ATCC CCL-61
마우스: 4T1	UVA의 Chip Landen 박사의 친절한 선물
마우스: MC38	UMBC Suzanne Ostrand-Rosenberg 박사의 친절한 선물	STR 프로파일링을 통해 인증됨

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