방법 논문

HA 항체에 의한 Fc 매개 효과기 기능의 활성화 측정

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

출처: Bailey, M. J., et al. 인플루엔자 헤마글루티닌 특이 항체에 의해 유도된 Fc 매개 효과기 기능을 평가하는 방법. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 T 세포 효과기 기능의 항체 매개 활성화를 측정하는 분석을 보여줍니다. HA를 발현하는 형질주입된 포유류 세포에 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 특이적 단일클론 항체를 추가하면 HA와 함께 면역 복합체가 형성됩니다. Fc 수용체를 발현하는 조작된 T 세포와 루시페라제 리포터를 도입하면 T 세포는 항체-HA 복합체에 의해 활성화되며, 이러한 활성화는 루시페라제 기질을 추가하고 생성된 생물 발광을 측정하여 검출됩니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Transfection을 통한 인플루엔자 바이러스 Hemagglutinin의 발현

  1. 백색 조직 배양 처리된 96-웰 플레이트에서 2 x 104 cells/well의 밀도로 인간 배아 신장(HEK 293T) 세포를 플레이트하고 37°C 인큐베이터(5% CO2 포함)에서 4시간 동안 그대로 둡니다.
  2. 총 부피 50 μL.
    에서 웰당 바이러스 헤마글루티닌을 위한 100 ng의 DNA 코딩과 0.2 μL의 transfection 시약으로 세포를 transfection합니다. 메모: 플라스미드 및 transfectant 시약은 모두 1x Opti-Minimum Essential Media(MEM) 감소 혈청 배지에 희석됩니다.
  3. 37°C 인큐베이터에서 5% CO2로 18시간 동안 플레이트를 배양한 후 transfection 배지를 제거합니다.

2. 단클론 항체 또는 혈청에 의한 루시페라제 활성의 FcRg/NFAT 매개 활성화 평가

  1. 먼저, transfection된 세포의 성장 배지를 25μL의 분석 배지(4%(vol/vol) low IgG 소 태아 혈청이 보충된 1x RPMI 1640)로 교체합니다.
  2. 별도의 96-well 플레이트에서 분석 배지를 사용하여 30μg/mL부터 시작하여 관심 항체를 4배 희석합니다. 세 배로 희석을 수행하고, 플레이트 레이아웃의 예가 그림 1A에 예시되어 있습니다. 항체를 제외하는 대조군(항체 대조군 없음)과 백그라운드 대조군(분석 완충액만)이 포함되어 있는지 확인합니다.
    메모: '항체 없음' 대조군과 백그라운드 대조군 모두에 대해 항체 대신 25μL의 분석 완충액을 추가합니다.
  3. Step 2.2에서 연속으로 희석된 항체 25 μL를 형질주입된 세포 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다.
  4. 37°C 인큐베이터(5% CO2 포함)에서 15분 동안 플레이트를 배양합니다.
  5. murine FcgRIV 또는 human FcgRIIIa(75,000 cells/well)를 발현하는 적절한 modified effector Jurkat 세포 25 μL를 추가합니다. 각 웰의 총 부피는 75μL여야 하며 항체의 시작 최종 농도는 10μg/mL입니다(그림 1B).
    메모: 백그라운드 대조군의 경우 effector cells 대신 25μL의 분석 버퍼를 추가합니다. 항체 의존성 세포 매개 식세포작용(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis)을 검사하기 위해 인간 FcgRIIa를 발현하는 변형된 Jurkat 세포를 사용할 수 있습니다.
  6. 37 ° C 인큐베이터에서 5 % CO2로 플레이트를 6 시간 동안 배양합니다.
  7. 사용하기 전에 37°C의 물에서 약 1시간 동안 루시페라아제 기질 완충액을 해동하고 따뜻하게 합니다.
    메모: 루시퍼라제 기질 완충액을 만들기 위해, 제공된 분석 버퍼에서 동결건조된 루시페라제 분석 기질을 재구성합니다. 재구성된 기질 버퍼는 -30°C에서 -10°C에서 최대 6주 동안 보관할 수 있습니다.
  8. 75 μL/well의 루시퍼라제 기질 완충액을 백그라운드 대조군을 제외한 모든 웰에 추가합니다.
  9. 광도계에서 읽으십시오.
  10. Fold induction = (Induced value-Background value) / (No mAb value-Background value) 방정식을 사용하여 fold induction 를 계산합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
그림 1: 실험군의 샘플 플레이트 레이아웃 및 구성의 개략도. (A) 각 항체 샘플의 시작 농도는 10μg/mL이며 플레이트(1열에서 12열까지)를 4배로 연속적으로 희석합니다. 각 샘플은 세 번으로 수행됩니다. G 행은 mAb 없음 제어용으로 예약되어 있고 H 행은 배경입니다. (B) 루시페라제 기질 완충액을 첨가하기 전 각 실험 그룹의 최종 부피는 75μL입니다. 참고로, 샘플과 'mAb 없음 그룹'에는 25μL의 effector cell이 추가된 반면, 배경 대조군 그룹에는 75μL의 분석 media가 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
HEK 293T 셀증권 시세CRL-3216인간 배아 신장 세포
리포펙타민 2000생명 기술11668019트랜스펙션(Transfection) 시약
1X Opti-MEM 리디즈드 세럼 미디엄써모피셔 사이언티픽51985-034
백색 조직 배양 처리된 96웰 플레이트코닝(Corning, Inc.)3917분석 플레이트
MEM 10개지브코11430-030
쥐를 발현하는 Jurkat 세포 FcgRIV프로메가M1201키트에는 세포, Bio-Glo Luciferase 분석 시스템, 1X RPMI 및 저 IgG 혈청이 포함됩니다
인간 FcgRIIIa를 발현하는 Jurkat 세포프로메가G7010키트에는 세포, Bio-Glo Luciferase 분석 시스템, 1X RPMI 및 저 IgG 혈청이 포함됩니다
인간 FcgRIIa를 발현하는 Jurkat 세포프로메가G9901키트에는 세포, Bio-Glo Luciferase 분석 시스템, 1X RPMI 및 저 IgG 혈청이 포함됩니다
광도계(주)바이오텍Synergy H1 다중 모드 리더기발광 플레이트 리더
Bio-Glo Luciferase 분석 시스템프로메가G7940 (영문luciferase 분석 버퍼와 luciferase 분석 기질 포함
표시기 (영문) 년 년 년 . . . )

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

HATNFATJurkat

관련 논문