중화 항체에 대한 인플루엔자 바이러스 탈출 변이의 생성

참고: 바이러스 복제를 억제하는 HA 특이적 항체는 일반적으로 i) 구상머리 상부의 수용체 결합 부위에 결합하거나 이에 인접한 항체와 ii) 구상두의 측면과 HA의 줄기 영역을 포함하는 수용체 결합 도메인의 원위부에 결합하는 항체로 분류할 수 있습니다. 수용체 결합 부위를 표적으로 하는 항체는 표적 세포 표면에서 시알산 모티프의 결합을 방지하며 HI(hemagglutination inhibition) 분석을 사용하여 측정할 수 있습니다. 줄기 특이적 항체와 같이 HI 음성인 항체는 여전히 바이러스 복제를 억제할 수 있지만 중화 분석을 통해서만 평가할 수 있습니다.

1. HI 활성에 따른 항체 분류

1. HI 분석
   1. 96웰 V-바닥 플레이트에서 컬럼 2 - 12에 25μL의 1x PBS를 추가합니다.
   2. 단클론 항체(mAb) 7B2(머리 특이적), 6F12(줄기 특이적) 및 동형 대조군을 1x PBS에서 100μg/mL로 희석하고 희석된 항체 제제 50μL를 컬럼 1에 분취합니다. 또한 50μL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)를 추가하여 mAb 없음 대조군을 포함합니다(그림 1A).
   3. 컬럼 1에서 컬럼 2로 25μL를 전달하는 방식으로 항체의 2배 연속 희석을 수행합니다. 컬럼 12에서 마지막 25μL를 버립니다(그림 1A).
      메모: 항체 대조군이 없는 행을 포함해야 합니다.
   4. 바이러스 스톡(A/California/04/09의 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다아제(NA)를 A/Puerto Rico/8/34의 내부 분절과 함께 발현하는 재조합 바이러스)를 8개의 헤마글루티닌 단위/25μL 희석된 바이러스 스톡으로 희석합니다. 25μL의 희석된 바이러스 스톡(8 hemagglutination)을 각 웰(행 A에서 G)에 추가합니다.
      메모: 항체 및 바이러스 혼합물의 최종 부피는 50μL이고 시작 최종 농도는 50μg/mL여야 합니다.
   5. 플레이트를 실온(RT)에서 45분 동안 배양합니다.
   6. 역적정 행(H)의 경우 웰 H2 - H12에 50μL의 1x PBS를 추가합니다. 8개의 적혈구 응집 단위 중 100μL/25μL를 well H1에 추가합니다. 50μL를 H1에서 H2로 전달하여 2배 직렬로 희석합니다. 웰 H12에서 마지막 50μL를 버립니다. 마지막으로, 50μL의 0.5% 닭 적혈구(RBC)를 96웰 V-바닥 플레이트의 모든 웰에 추가합니다.
      메모: 분석에서 mAb 샘플의 최종 부피는 100μL, 즉 mAb(25μL), 바이러스(25μL) 및 RBC(50μL)여야 합니다. mAb 없음 대조군의 최종 부피에는 25μL의 1x PBS, 25μL의 바이러스 및 50μL의 적혈구가 포함되어야 합니다.
   7. 플레이트를 4°C에서 1시간 동안 배양합니다.
   8. HI 활동을 위해 플레이트를 육안으로 읽습니다. 특정 항체에 대한 positive readout이 있는 경우 2.1단계로 진행하여 escape variant를 생성합니다. 항체가 HI-음성인 경우 아래 1.2단계로 진행하여 세포 배양 분석에서 항체가 중화 활성이 있는지 평가합니다.
      메모: HI-active mAb의 양성 판독값은 96웰 V-바닥 플레이트가 45° 각도로 유지될 때 눈물 방울을 형성하는 웰 중앙의 짙은 빨간색 RBC 펠릿(그림 1B; 7B2)으로 표시됩니다. 음의 판독값은 웰에서 짙은 적색 RBC 펠릿을 형성하지 않습니다(그림 1B; 6F12 및 mAb 없음). 또한 isotype control은 짙은 적색 RBC pellet를 형성하지 않으며 줄기 특이적 항체인 6F12 또는 no mAb control 샘플과 동일하게 보여야 합니다(그림 1B).

2. 탈출 돌연변이 변종의 생성

참고: HI 활성이 있거나 없는 중화 항체는 아래에 설명된 특정 프로토콜로 추가로 분석됩니다.

1. 프로토콜 1: HI-positive/Neutralization-positive 항체(그림 2A)
   1. 400μL 부피의 1x PBS에 10⁶ 플라크 형성 단위/밀리리터(PFU/mL)의 바이러스 스톡을 준비합니다.
   2. 희석액당 100μL의 부피로 1x PBS의 농도 증가(예: 0, 0.5, 0.05 및 0.005 mg/mL)에 대한 관심 항체의 4가지 희석액을 준비합니다
      참고: 야생형 바이러스는 항상 항체가 없는 상태에서 병렬로 통과해야 합니다. 이러한 계대형성된 바이러스의 염기서열은 세포 배양 조건에 대한 적응과 탈출 돌연변이를 구별하는 데 도움이 됩니다.
   3. 100 μL의 10⁶ PFU/mL 바이러스를 각 항체 희석 100 μL 또는 1 x PBS 100 μL와 혼합합니다.
   4. 37 ° C 인큐베이터에서 1 시간 동안 배양합니다 (5 % CO₂ 포함). 소용돌이, 간략히. 각 혼합물 200μL를 특이 병원체가 없는(SPF) 배아 계란에 주입합니다.
   5. 알을 37 ° C (CO₂ 없음)에서 40-44 시간 동안 부화시킵니다.
   6. 바이러스에 감염된 배아 난자를 4°C에서 최소 6시간 동안 부화시켜 희생시킵니다.
   7. 앞에서 설명한 대로 계란에서 알란토스 액체를 수확합니다.
   8. 위에서 설명한 대로 혈응집 분석을 수행합니다. 모든 알란토산 수액 제제에 혈응집 역가가 없는 경우 0.005mg/mL에서 0.00005mg/mL.
      범위의 항체 희석으로 2단계부터 반복합니다 메모: HI 양성 항체의 포화 농도는 존재하는 모든 바이러스 입자를 중화할 수 있습니다. 따라서 계대 징수에 존재하는 항체의 양을 감소시킬 필요가 있을 수 있습니다.
   9. HI assay(step 1.1)를 수행하여 escape variant를 확인합니다.
      메모: HI-active 항체는 표적 세포에서 시알산 모티프의 HA 관여를 차단합니다. 따라서 동족 항체가 있는 바이러스는 적혈구를 응집하는 능력(적혈구 펠릿의 존재)을 잃게 됩니다. 이론적으로, HI-active 항체의 탈출 변이체는 동족 항체가 있는 경우에도 시알산 모티프와 계속 결합할 수 있으므로 RBC(RBC 펠렛 없음)를 응집시킬 수 있습니다. 관심 항체의 HI가 여전히 검출 가능한 경우, 더 높은 항체 시작 농도로 2.1.2단계부터 프로토콜을 반복합니다.

그림 1: HI 분석. (A) 96웰 V-바닥 플레이트를 사용하여 두 개의 마우스 H1 특이적 mAbs 7B2(머리 특이적) 및 6F12(스토크 특이적)의 활성을 테스트하기 위한 HI 분석 설정 개략도, (B) HI 분석 결과의 예

그림 2: 탈출 돌연변이의 세대. 제안된 방법론은 HI와 항체가 나타내는 미세중화 활성에 따라 달라집니다. (A) 중화하는 HI-양성 항체에 대한 탈출 돌연변이의 생성은 난자에서 단일 통로를 필요로 할 수 있는 반면, (B) 중화하는 HI-음성 항체는 세포 조직 배양에서 항체 양이 증가하는 여러 통로를 포함할 수 있습니다.