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방법 논문

포유류 세포 배양에서 재조합 단클론 항체 생성

1.2K 조회수

⸱

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

출처: Nogales-Gadea, G. et al., 불멸화된 분류 B 세포에서 재조합 인간 IgG 단클론 항체 생성.J. Vis. 특급(2015년)

이 동영상은 중쇄 및 경쇄 유전자를 가진 플라스미드 벡터를 도입하여 포유류 세포에서 항체를 생성하는 방법을 보여줍니다. 이 벡터는 폴리에틸렌과 상호 작용하고 폴리플렉스를 형성하여 세포에 들어갑니다. 나중에, 그들은 개별 단백질로 번역되어 완전한 항체로 조립되어 세포 외 배지로 분비됩니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 말초혈액 단핵세포(PBMC)의 분리

  1. 참가자의 헤파린화된 혈액 25ml를 900 x g에서 15분 동안 혈액 추출 후 가능한 한 빨리 원심분리합니다. 혈액이 적으면 그에 따라 시약을 줄이십시오. 후드에서 다음 모든 단계를 수행합니다.
  2. 깨끗한 튜브에 세럼을 옮깁니다. PBMC를 동결하기 위한 이후 단계 또는 자가면역 환자의 경우 자가항체를 검사하는 데 사용할 수 있습니다.
  3. 10ml의 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 배지로 혈액을 희석하고 위아래로 피펫팅하여 세포를 재현탁합니다.
  4. 폴리수크로스와 디아트리조산나트륨(1.077g/ml)이 함유된 용액 15ml를 새 50ml 튜브에 추가합니다.
  5. 1.4단계에서 두 액체가 매우 천천히 접촉할 때까지 튜브의 두 구멍을 서로 가깝게 하여 용액 위에 혈액을 부드럽게 층을 이룬 다음 50ml 튜브 위에 PBMC 현탁액을 천천히 디캔팅합니다. 이 단계는 PBMC를 잘 분리하는 데 중요합니다.
  6. 단계 1.5에서 얻은 튜브를 400 x g에서 브레이크 없이 실온(RT)에서 20분 동안 원심분리합니다.
  7. 원심분리 후 PBMC가 들어있는 튜브의 중간 부분에 나타나는 흰색 고리를 피펫으로 회수합니다.
  8. 25ml의 RPMI 1640 배지로 셀을 세척합니다.
  9. 원심분리기 300 x g, 상온에서 10분간
  10. 상층액을 버리고 10ml의 RPMI 1640으로 세포를 세척합니다. 1.9단계에서와 같이 다시 원심분리기를 사용합니다.
  11. 이전에 보고된 바와 같이 Neubauer 챔버가 있는 PBMC를 계산합니다.
  12. 섹션 2와 같이 PBMC를 처리하거나 다음과 같이 나중에 사용하기 위해 보관하십시오: 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO) 1ml와 1.2단계에서 얻은 90% 혈청에 희석된 극저온 튜브당 동결을 위한 1,000만 PBMC를 보관합니다. 액체 질소에 점진적으로 장기간 보관하기 위해 동결하십시오.

2. 세포 세포 분석에 의한 CD22+ 및 면역글로불린 G(IgG+) 분류를 위한 PBMC 염색

  1. 25cm2 세포 배양 플라스크에 PBMC를 6ml의 완전한 RPMI 1640 배지(L-글루타민, 10mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 완충액, 50U/ml 페니실린, 50μg/ml 스트렙토마이신 및 10%의 소 태아 혈청으로 보충하고 37°C의 인큐베이터에서 5% 이산화탄소(CO2)로 O/N을 회수합니다.
  2. 멸균 형광 활성화 세포 분류(FACS) 튜브를 멸균 4% 알부민 인산염 완충 식염수(PBS) 용액으로 하룻밤(O/N) 차단합니다. PBS로 튜브를 두 번 세척하고 500μl의 완전한 RPMI 1640 배지로 채웁니다. 분류 후 세포를 회수하기 위해 이 튜브를 사용하십시오.
  3. 튜브에 PBMC를 넣고 실온에서 400 x g로 5분 동안 원심분리합니다.
  4. 레이블 지정 버퍼에서 셀을 다시 중단하고(2.5 및 2.6단계 참조) 개수를 계산합니다. 라벨링 버퍼는 PBS의 멸균 2% 소 태아 혈청과 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)입니다.
  5. 각각 10개의5개 셀이 있는 3개의 FACS 튜브를 준비하고 100μl의 라벨링 버퍼에 재현탁합니다. 이 튜브는 분류의 게이트를 정의하는 데 사용됩니다.
    1. 첫 번째 튜브에 5μl의 anti CD22 PerCP 항체(제조업체 데이터시트에 권장됨)를 추가하고, 두 번째 튜브에 20μl의 anti IgG PE(제조업체 데이터시트에 권장됨)를 추가하고, 세 번째 튜브에는 아무것도 추가하지 않습니다. 얼음 위와 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다.
  6. FACS 튜브에 200μl의 라벨링 버퍼에 500만 개의 세포를 재현탁시키고 10μl의 anti CD22 PerCP 및 40μl의 anti IgG PE를 추가합니다. 30분 동안 얼음과 어두운 곳에서 세포를 배양합니다. 더 많은 수의 세포를 분류해야 하는 경우 모든 시약을 스케일업합니다.
  7. 400 x g에서 원심분리기 셀, RT에서 5분 동안 낮은 브레이크.
  8. 상층액을 부드럽게 디캔팅합니다.
  9. 500μl의 라벨링 완충액에 세포를 재현탁합니다. 400 x g의 원심분리기 셀, RT에서 5분 동안 낮은 브레이크로 2.7 및 2.8 단계를 반복합니다.
  10. 상층액을 부드럽게 디캔팅하고 300μl의 RPMI 완전 배지에 세포를 재현탁합니다.
  11. 세포를 0.45μm 필터에 통과시킵니다. 셀을 정렬할 준비가 되었습니다.

3. B 세포 CD22+ 및 IgG+ 분류

  1. 3개의 제어 튜브를 사용하여 세포의 생존 가능성을 확인합니다. 염색이 없는 대조군에서는 전방 및 크기 산점도를 사용하여 림프구 게이팅을 정의합니다. CD22 PerCP 및 anti-IgG PE를 사용한 컨트롤은 게이트와 분류 게이트를 설정하는 역할을 합니다. 이전에 보고된 다음 데이터를 수행합니다.
    참고: 게이트(gate)는 특정 그룹의 세포분석(cytometric) 이벤트(우리의 경우 세포)를 큰 집합에서 격리하는 역할을 하는 값 한계(경계)의 집합입니다. sorting gate의 경우 값 한계는 정의된 경계 내부에 있는 세포분석 이벤트, 세포의 복구를 허용합니다: CD22+ 및 IgG+.
  2. 분류 시 수집 튜브로 2.2단계에서 얻은 500μl의 완전한 RPMI 1640 배지와 함께 차단된 튜브를 사용합니다.
  3. 이중 양성 정렬을 진행합니다: CD22+ IgG+. 각 조건의 최종 셀 수를 확인합니다. 가능한 한 빨리 피더 셀 위에 세포를 플레이트로 분류합니다.

4. 피더 셀의 조사

참고: 분류하기 1-3일 전에 피더 셀 준비를 수행하십시오. 96개의 원형 웰 플레이트에서 웰당 최소 5,000개의 wi38 셀이 필요합니다. 후드에서 4.1, 4.2 및 4.4 단계를 수행합니다.

  1. 원하는 세포 수에 도달할 때까지 완전한 RPMI 1640 배지(PBMC와 동일)에서 37°C 및 5% CO2에서 wi38 세포를 배양합니다.
  2. 앞에서 설명한 프로토콜에 따라 50 Grays에서 조사합니다. wi38 세포가 트립신화되고 완전한 RPMI 배지에 재현탁된 후 또는 wi38을 배양 플라스크에 부착하고 방사선 조사 후 트립신화된 상태에서 방사선 조사를 수행합니다. wi38 세포 공급업체가 지정한 트립신화 방법을 따릅니다. IgG+ B 세포 도금에 필요한 웰을 덮는 데 필요한 세포 수(1.11단계에서 계산한 총 PBMC의 1%)를 조사합니다.
  3. 96개의 원형 웰 플레이트의 각 웰에 5,000개의 방사선 조사된 wi38 세포를 포함하는 플레이트 90 μl. 플레이트의 바깥쪽 줄에 있는 웰은 비워 두고(더 빨리 증발하기 때문에) 플레이트 중앙에 있는 60개의 웰만 도금 셀에 사용합니다. 플레이트를 구성하는 외부 웰에 200μl의 PBS를 채웁니다.
  4. 필요할 때까지 37°C에서 5% CO2의 인큐베이터에 넣습니다.

5. 도금 분류 PBMCs, 엡스타인-바 바이러스 (EBV) 감염 및 성장

  1. 분류된 PBMC를 희석하여 96개의 원형 웰 플레이트(이전에는 wi38 조사된 세포로 도금됨)의 웰당 50μl의 RPMI 1640 완전 배지에 50개의 세포를 플레이트합니다. EBV 작업을 위해 장비를 갖춘 후드를 착용하고 단계를 수행합니다.
    참고: 웰당 50개 세포의 감염이 최적화되어 단클론 항체를 생성할 가능성을 높이지만, 앞서 설명한 대로 중합효소연쇄반응(PCR)으로 이를 확인하는 것이 좋습니다.
  2. 60 μl의 EBV 상등액(3 - 4 x 108 viral copies/ml 포함)을 96 원형 웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다.EBV 작업 중에는 주의해야 합니다.
  3. 웰당 1μg/ml의 CpG(ODN2006)를 추가합니다.
  4. 세포를 37 ° C에서 5 % CO2 인큐베이터에 두십시오.
  5. 일주일 후 현미경으로 클론이 자라는 것을 육안으로 모니터링합니다.
    참고: B 세포 성장의 몇 가지 예는 아래 결과 섹션에서 볼 수 있습니다. 클론의 성장 속도는 다양할 수 있으며, 우물 중앙에서 일부 세포 덩어리가 자라는 것을 보기 시작하는 데 추가 시간이 필요할 수 있습니다.
  6. 1st 2 주 후 광학 현미경 하에서 자라는 클론을 모니터링하고 첫 번째 배지 교환을 진행합니다. 웰의 상단 부분에서 90μl의 배지를 천천히 피펫으로 주입하고 깨끗한 96웰 플레이트에 수집합니다. (B 세포는 우물 바닥에 있으므로 흡인할 위험이 없습니다.)
    1. 각 웰에 1μg/ml의 CpG(ODN2006)와 50U/ml의 IL2가 보충된 100μl의 완전한 RPMI 1640 배지를 추가합니다. 클론이 성장하는 경우 6단계와 같이 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)을 통해 첫 번째 배지 교환을 분석합니다.
  7. 90 μl의 매체를 가지고 가고 CpG (ODN2006)의 1 μg/ml 및 IL2의 50 U/ml로 보충된 완전한 RPMI 1640 매체의 100 μl를 추가해서 다시 성장의 3 그리고 4 주 후에 증식을 감시하고 매체를 변화하십시오. 수집된 상층액을 사용하여 6.
    단계와 같이 ELISA에 의한 IgG 생산을 모니터링합니다. 참고: 1개월 후 클론 성장은 일반적으로 둥근 바닥 우물의 중간에 있는 둥근 세포의 응집체를 관찰하여 분명해야 합니다.
  8. 이 단계에서는 이전 주와 동일한 방식으로 미디어를 교체하되 완전한 RPMI 1640 미디어로만 미디어를 변경합니다. 미디어를 변경할 적절한 순간을 알 수 있는 좋은 지표는 미디어 색상이며, 노란색을 띤 세포가 되는 경우 미디어 교환이 필요합니다.
  9. 96웰 플레이트에 큰 클론(약 5 x 105 셀)이 포함되어 있는 경우 24웰 플레이트의 평평한 웰로 옮깁니다. 300μl의 완전한 RPMI 1640 배지를 새 웰에 추가합니다. 96-well growing 클론을 위아래로 여러 번 피펫팅하여 재현탁시키고 세포를 새로운 well로 옮겨 균질하게 분포시킵니다. 필요한 경우 새 미디어를 추가합니다.
    1. 24웰 플레이트의 웰에 셀(약 5 x 106 셀)이 가득 차면 6웰 플레이트의 평평한 웰로 옮깁니다. 전체 RPMI 1640 배지 2ml를 새 웰에 추가합니다. 24웰 플레이트에 여러 번 위아래로 피펫팅하여 세포를 재현탁시키고 새 웰에 균일하게 분포시킵니다.
  10. 필요한 경우 미디어를 추가합니다. 배양에서 세포를 유지하지 않을 경우, RT에서 5분 동안 400 x g에서 세포를 펠렛화합니다. ELISA 테스트를 위해 상등액을 보관합니다. 세포 펠릿을 1 x PBS로 한 번 세척하고 400 x g에서 5 분 동안 다시 원심 분리기하고 RNA 추출까지 -80 ° C에서 건조하게 보관합니다.
    1. 6-well 플레이트의 세포가 합류하면(약 20 x 106 세포) 60mm 배양 플레이트로 이동합니다. 전체 RPMI 1640 배지 4ml를 새 플레이트에 추가합니다. 6-well 플레이트에 세포를 재현탁하고 5.9 및 5.10 단계에 따라 세포를 옮깁니다.
  11. 필요한 경우 새 미디어를 추가합니다. 이 단계에서 90% 태아 송아지 혈청과 10% DMSO에서 10 – 3000만/ml로 세포를 동결합니다. 더 많은 양의 세포가 필요한 경우, 더 큰 표면판에서 클론의 확장을 계속하십시오.

6. IgG 항체 검출을 위한 ELISA

  1. 코팅 완충액에 1 200으로 희석된 염소 F(ab)2 항인간 Fc 항체의 ELISA 플레이트에 50μl/웰을 분배합니다. 코팅 버퍼에는 50mM 탄산나트륨(Na2CO3) pH 9.6이 포함되어 있습니다.
  2. 플라스틱 스티커로 플레이트를 밀봉하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 또는 4°C O/N에서 배양합니다.
  3. 200μl의 세척 버퍼로 각 웰을 6회 세척합니다. 세척 버퍼에는 1 x PBS에 0.05% Tween-20이 포함되어 있습니다. 항체가 결합된 웰 표면을 만지거나 긁지 마십시오.
  4. 블로킹 버퍼가 있는 블록, 100μl/well. 차단 버퍼에는 PBS에 4%의 무지방 분유가 포함되어 있습니다. 플레이트를 밀봉하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
  5. 씻지 마십시오. 차단 버퍼를 버리고 종이 타월로 플레이트를 거꾸로 3회 두드려 잔여 액체를 제거합니다.
  6. 클론의 상층액과 표준물질을 배양합니다.
    1. 첫 번째 테스트의 경우, 5.6 단계에서 얻은 복제 상등액을 RPMI에서 5.6 또는 5.7 1/3로 희석합니다. RPMI 배지 인간 IgG 용액으로 희석한 표준물질의 경우: 1,000ng/ml, 500ng/ml, 250ng/ml, 125ng/ml, 62.5ng/ml, 31.25ng/ml, 15.6ng/ml 및 블랭크. 50 μl/well을 사용하고 37 °C에서 60분 동안 배양합니다. 클론 상등액의 추가 희석액을 분석하여 1/10 또는 1/100과 같은 항체 친화도를 테스트합니다.
  7. 6.3단계에서 수행한 대로 세척합니다.
  8. 배양 완충액에 1:20,000으로 희석된 50μl/well의 염소 F(ab)2 anti-human IgG Fc peroxidase conjugated 를 사용합니다. 배양 완충액에는 1x PBS에 1% 소 혈청 알부민(BSA)과 0.02% Tween 20이 포함되어 있습니다. 37°C에서 60분 동안 배양합니다.
  9. 6.3단계에서 수행한 대로 세척합니다.
  10. 0.1% 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 함유하는 100μl/웰 기질 용액을 추가합니다. 웰에 안정적인 파란색이 형성될 때까지 10분 동안 배양합니다. 조심하세요; 너무 오래 기다리지 마십시오!
  11. 50 μl의 2 M 황산 (H2SO4 )을 첨가하여 반응을 중지하십시오. 반응을 멈춘 후 30분 이내에 450nm에서 흡수를 측정합니다.
    참고: 블랭크에 대해 3 표준 편차를 가진 모든 클론의 상등액은 IgG 인간 항체에 대해 양성으로 간주됩니다. 양성 클론을 확인하기 위해 이 ELISA는 동일한 클론의 다른 상층액에서 최소 3회 반복해야 합니다. 또한 비특이적 교차 반응성의 가능성을 버리기 위해 코팅되지 않았지만 막힌 웰에서 상층액을 배양할 때 신호가 없는지 확인하는 것이 좋습니다. 이 단계에서, 섹션 7로 진행하기 전에 관심있는 항체의 항원 특이성을 스크리닝하기 위한 검출 분석을 수행할 수 있습니다.

7. IgG 클론 생산의 RNA 분리 및 1차 가닥 상보적 DNA(cDNA) 합성

  1. ELISA에 의해 IgG의 생산이 확인되는 즉시 클론의 RNA를 추출합니다.
  2. 5.7단계 또는 5.9단계에서 성장하는 세포에서 RNA를 추출하려면 10,000개의 세포에서 하나의 세포로 DNA를 얻을 수 있는 위 첨자 III 세포 직접 cDNA 합성 키트를 사용하십시오.
  3. 더 많은 양의 세포에서 RNA를 추출하거나 5.11단계에서 보관된 펠릿에서 RNA를 추출하려면 고순도 RNA 분리 키트를 사용하십시오. RNA 추출의 다른 시스템도 이 단계에서 적합할 수 있습니다. 제조업체의 지침을 따르십시오.
  4. 1 x 106 및 1 x 104 사이의 세포 번호의 경우 제조업체의 지침에 따라 역전사 시스템을 사용하십시오. 첫 번째 가닥 cDNA 합성을 위한 다른 시스템도 사용할 수 있습니다.

8. IgG 생성 B 세포 클론의 중쇄 및 경쇄 증폭을 위한 1차 및 2차 PCR

  1. 단계 5.6 및 5.7에서 얻고 단계 6에서 IgG ELISA에서 양성인 세포 클론의 cDNA를 사용하여 표 1에 나열된 프라이머로 PCR을 수행합니다.
  2. 각 IgG heavy, kappa 및 lambda chain에 대해 독립적인 PCR을 설정합니다. 정방향 및 역방향 프라이머가 동일한 농도로 있는 원액을 만듭니다. 0.4 μM 최종 농도에서 반응에 추가합니다.
  3. 1 ST PCR을 수행하기 위해 1 μl의 cDNA 합성을 사용합니다. 여기에서는 Takara Taq 제조업체 지침을 사용하여 20μl 반응을 수행합니다. 또는 다른 중합효소를 사용하십시오.
  4. 1st PCR을 다음의주기 조건 하에서 배치하십시오 : 94 ° C 5 분; (50 사이클 : 30 초 동안 94 °C, 30 초 동안 58 °C, 45 초 동안 72 °C, 7 분 동안 72 °C, 가능한 오염을 감지하기 위해 반응에 공백을 포함하여 4 °C에서 식히십시오.
  5. 1x TBE(89mM 트리스보레이트 및 2mM EDTA)를 준비합니다. 100ml의 1x TBE 용량에 아가로스 1g(1% 아가로스 젤)을 추가합니다. 아가로스가 녹을 때까지 전자레인지에서 용액을 약 1분 동안 가열합니다. 그런 다음 4μl의 10mg/ml 브롬화 에티듐(또는 이에 상응하는 DNA 염료)을 넣고 섞습니다.
    1. 트레이에 내용물을 붓고 중합될 때까지 기다립니다. 밴드를 시각화하기 위해 겔에서 PCR 혼합물 5μl를 실행합니다. 중쇄 단편은 약 400 - 550 bp, 경쇄 절편은 약 300 - 400 bp여야 합니다. 밴드가 검출되지 않으면 2차 PCR도 마찬가지로 진행합니다.
  6. 첫 번째 PCR 혼합물 1μl를 사용하여 2차 PCR을 수행합니다. 8.2단계와 동일한 시약을 사용하되 적절한 프라이머 혼합물을 사용합니다(표 1 참조). 2차 PCR의 경우 다음 조건을 사용하십시오 : 94 ° C에서 5 분; (50 사이클 : 30 초 동안 94 ° C, 30 초 동안 56.5 ° C 및 55 초 동안 72 ° C); 7 분 동안 72 ° C; 4 °C에서 식히십시오., 가능한 PCR 오염을 감지하기 위해 반응에 공백을 포함하십시오.
  7. 8.5에 설명된 대로 아가로스 젤을 준비합니다. 8.5.1에서와 같이 PCR 산물을 시각화하기 위해 겔을 실행하고 9단계에서 클로닝을 위한 올바른 크기의 단편을 포함하는 증폭을 사용하고 10단계에서 항체를 생성합니다.
  8. 100 ng의 2 차 PCR, 0.2 μM의 프라이머 또는 프라이머 혼합물, 1 μl의 터미네이터 및 1 μl의 완충액을 포함하는 10 μl 반응을 사용하여 DNA를 서열분석합니다. 다음 조건 하에서 시퀀싱 반응을 수행합니다 : (25 사이클 : 96 ° C 10 초, 50 ° C 5 초, 및 60 ° C에서 4 분); 60 °C에서 7 분; 4 °C에서 식히십시오.
  9. 제조업체의 지침에 따라 microspin G50 컬럼으로 염기서열분석 반응을 정제합니다. 앞에서 설명한 대로 자동 염기서열 분석기에서 접합 염기서열을 평가합니다. 전기표는 깨끗해야 하며 단일 면역글로불린 염기서열과 일치해야 합니다.
    참고: PCR 산물이 불분명하거나 혼합된 면역글로불린 염기서열을 보이는 경우 TopoTA 시스템을 사용하여 복제하여 분리된 염기서열을 얻은 다음 9단계로 진행하는 것이 좋습니다.

9. IgG 클론 생산의 중쇄 및 경쇄의 복제 및 시퀀싱

  1. 벡터 pFUSE2ss-CLIg-hk, pFUSE2ss-CLIg-hl2 및 pFUSEss-CHIg-hG1의 DNA 1μg을 준비합니다.
  2. 이러한 벡터를 적절한 제한 효소로 분해합니다. pFUSE2ss-CLIg-hk의 경우 EcoRI 및 BsiWI를, pFUSE2ss-CLIg-hl2의 경우 EcoRI 및 AvrII, pFUSEss-CHIg-hG1의 경우 EcoRI 및 NheI를 사용합니다. 벡터의 DNA 1μg에 대해 각 제한 효소 3 단위를 사용합니다.
    1. 하나의 효소로 분해하고 PCR 정제 키트로 분해된 산물을 정제합니다. 두 번째 효소로 소화하고 Gel Extraction Kit(겔 추출 키트)로 정제합니다(제조업체의 프로토콜에 따름). 아가로스 겔에서 관심 있는 조각을 자릅니다. 8.5단계와 같이 아가로스 젤을 준비합니다.
  3. 생산 IgG 클론의 2차 PCR 산물을 분해합니다: 카파 사슬 증폭을 위한 EcoRI 및 BsiWI, 람다 사슬 증폭을 위한 EcoRI 및 AvrII, 중쇄 증폭을 위한 EcoRI 및 NheI. 하나의 효소로 분해하고 PCR 정제 키트로 분해된 산물을 정제합니다. 두 번째 효소로 분해하고 PCR 정제 키트로 소화된 생성물을 정제합니다. 9.2단계와 동일한 단위의 효소와 DNA를 사용합니다.
  4. 제조업체의 권장 사항에 따라 T4 DNA 리가제 16 °C O/N으로 벡터 내부의 PCR 단편을 접합합니다. 사용되는 비율은 1 : 2 (vector : insert)이어야합니다.
  5. 1μl의 결찰을 사용하여 DH5α 박테리아를 변형시킵니다. DH5α 제조사의 변형 조건을 따르십시오. 사용된 벡터의 유형에 따라 blasticidin 또는 zeocin plates에 박테리아를 퍼뜨립니다. 플레이트 O/N을 37°C에서 배양합니다.
  6. 단일 콜로니를 성장시키고 제조업체의 지침에 따라 miniprep 키트로 DNA를 추출합니다. 단일 콜로니 성장 및 DNA 추출에 사용하는 것은 제조업체의, DNA miniprep 키트의 권장 사항입니다. 9.2 및 9.3 단계에서와 같이 벡터 및 삽입물을 준비하는 데 사용되는 효소를 사용하여 분해하여 분석합니다.
  7. 8.8 및 8.9 단계에서 수행한 것처럼 100ng의 벡터를 사용하여 DNA를 염기서열분석합니다.

10. HEK 세포에서 항체 생산

  1. 150mm 세포 배양 플레이트에서 10% 태아 송아지 혈청, 1% L-포도당, 1% 페니실린/스트렙타비딘(DMEM+)이 보충된 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)에서 HEK 세포를 75%의 포화도까지 성장시킵니다. 후드 단계 10.1에서 10.7로 수행합니다.
  2. transfection 전에 이전과 같이 배지를 배지에서 배지로 교환하되 태아 송아지 혈청은 사용하지 마십시오.
  3. 각 중쇄 transfection에 대해 DMEM 2.5ml(혈청 제외), 중쇄 벡터 9μg, 경쇄 벡터 6μg 및 폴리에틸렌이민(PEI) 용액 100μl(1μg/μl 스톡)와 함께 형질 주입 혼합물을 준비합니다. RT에서 15분 동안 배양합니다.
  4. 10.3단계에서 준비한 형질주입 혼합물 2.5ml를 플레이트의 HEK 세포에 부드럽게 첨가합니다. 접시를 흔들어 균일하게 분포시킵니다.
  5. 37°C의 인큐베이터에서 24시간 동안 5% CO2로 세포를 배양합니다.
  6. 배양 배지를 태아 송아지 혈청이 없는 배지로 변경합니다.
  7. 4일 후에 플레이트에서 배지를 수집합니다.
    참고: 배지 내의 항체는 in vitro 및 in vivo의 반응성을 특성화하는 데 사용할 수 있습니다.

표 1. 프라이머가 사용되었습니다.

표시기 표시기 ) ) ) 표시기
1st PCR 프라이머
전진(5'-3')반전 (3' - 5')
IgG5" L-VH 1 ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG3" Cγ CH1 GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC
5" L-VH 3 AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG
5" L-VH 4/6 CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG
5" L-VH 5 CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG
κ5" L Vκ 1/2 ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG3" Cκ 543 GTTTCTCGTAGTCTGCTTTGCTCA
5" L Vκ 3 CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG3" Cκ 494 GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT
5" L Vκ 4 ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTG
5" 팬 Vκ ATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG
λ5" L Vλ 1 GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTG3" Cλ CACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTTG
5" L Vλ 2 GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG
5" L Vλ 3 GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG
5" L Vλ 4/5 GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG
5' L Vλ 6 GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG
5" L Vλ 7 GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG
5" L Vλ 8 GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG
2nd PCR 프라이머
전진(5'-3')반전 (3' - 5')
IgH5" EcoRI VH1 CAACCGGAATTCGCAGGTGCAGCTGG
증권 시세		3" JH 1,2,4,5 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGT
가카그
5" EcoRI VH1 - 5 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG
지지카그		3" 번호 JH 3 CTGCTAGCTAGCTGAGAGACGGTGA
증권 시세
5" EcoRI VH3 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG
지티가그		3" 번호 JH 6 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGTG
계정
5" EcoRI VH3 23 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCT
GTTGGAG
5" EcoRI VH4 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCT
가가그
5" EcoRI VH 4 34 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCTAC
아그카그그
5" EcoRI VH 1 18 CTTCCGGAATTCACAGGTTCAGCT
GGTGCAG
5" EcoRI VH 1 24 CTTCCGGAATTCACAGGTCCAGCT
GGTACAG 그타카그
5" EcoRI VH3 33 CTTCCGGAATTCACAGGTGCAGCT
GGTGGAG 그그트가그
5" EcoRIVH 3 9 GATCCGGAATTCAGAAGTGCAGCT
GGTGGAG 그그트가그
5" EcoRI VH4 39 GATCCGGAATTCACAGCTGCAGCT
가가그
5" EcoRI VH 6 1 GATCCGGAATTCACAGGTACAGCT
지카그(GCAGCAG)
κ5" EcoRI Vκ 1 5 CAACCGGAATTCAGACATCCAGATGA
CCCAGTC (영문		3" BsiWI Jκ 1 to 4 GCCACCGTACGTTTGATYTCCACCTTGGTC
5" EcoR1 Vκ 1 9 CTTCCGGAATTCAGACATCCAGTTGAC
CCAGTCT		3" BsiWI Jκ 2 GCCACCGTACGTTTGATCTCCAG
CTTGGTC
5" EcoR1 Vκ 1D 43 CTTGGCGAATTCAGCCATCCGGATGA
CCCAGTC (영문		3" BsiWI Jκ 3 GCCACCGTACGTTTGATATCCACT
티그그씨
5" EcoR1 Vκ 2 24 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATGA
CCCAGAC (영문
5" EcoR1 Vκ 2 28 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATG
액트카그씨
5" EcoR1 Vκ 2 30 CTTCCGGAATTCAGATGTTGTGATGA
CTCAGTC
5" EcoR1 Vκ 3 11 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTG
아카카그씨
5" EcoR1 Vκ 3 15 CTTCCGGAATTCAGAAATAGTGATG
ACGCAGTC
5" EcoR1 Vκ 3 20 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTGA
CGCAGTCT
5" EcoR1 Vκ 4 1 CTTCCGGAATTCAGACATCGTGATG
ACCCAGTC
λ5" EcoR1 Vλ 1 CTTCCGGAATTCACAGTCTGTGCT
갯카그		3" AvrII Jλ 1 to 3 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTSACCT
증권 시세
5" EcoR1 Vλ 2 CTTCCGGAATTCACAGTCTGCCC
티작카그		3" AvrII Jλ 4 CTGGTTACCTAGGAAAATGATCAGC
TGGGTTCC
5" EcoR1 Vλ 3 CTTCCGGAATTCATCCTATGAGC
티지악카그		3" AvrII Jλ 5 CTGGTTACCTAGGAGGAGGACGGTCAGC
티씨그씨씨피
5" EcoR1 Vλ 4 to 5 CTTCCGGAATTCACAGCYTGTG
CTGACTCA		3" AvrII Jλ 6 CTGGTTACCTAGGAGGAGGACGGTCAGCT
GGGTGCC
5" EcoR1 Vλ 6 CTTCCGGAATTCAAATTTTATGC
티작카그		3" AvrII Jλ 7 CTGGTTACCTAGGAGGAGGACGGTCAC
TTGGTCCAT
5" EcoR1 Vλ 7-8 CTTCCGGAATTCACAGRCTGTG
지가싸이카그

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재료

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이름회사카탈로그 번호댓글
히스토파크-1077 시그마-알드리치10771폴리자당과 디아트리조산나트륨을 함유하는 용액
FACSAria II 세포 분류기 BD 바이오사이언스
96 U자형 바닥 마이크로 웰 플레이트 코스타3799
고급 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 매체 Gibco, 라이프 테크놀로지스제12633-020
B95-8 세포주의 30% v/v EBV 함유 상등액 증권 시세CRL-16123.4 x 108 복사/ml
CPG2006 인비보젠ODN 7909
Wi38 셀 시그마-알드리치90020107
인터루킨-2로슈 10799068001
ELISA 플레이트Greiner Bio-One, 마이크론655092
AffiniPure F(ab')2 단편 염소 항인간 IgG, Fcγ 단편 특이적(비접합)잭슨 이뮤노리서치Tel.: 109-006-008
4% 무지방 분유(블로팅 등급 차단기) 비오라드제170-6404
인간 IgG 시그마나는 2511HUMAN IgG 정제 면역글로불린, 5.6 mg/ml
염소 F(ab)2 항인간 IgG Fcγ(과산화효소(PO)와 접합)잭슨 이뮤노리서치Tel.: 109-036-008
ELISA 리더 (Perkin Elmer 2030) 퍼킨 엘머 2030-0050
과산화효소 접합 AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5μ 잭슨 이뮤노리서치Tel.: 309-035-095
SuperScript III 세포 직접 cDNA 합성 시스템 인비트로젠 18080-200
Applied Biosystems(ABI) GeneAm PCR 시스템 2700어플라이드 바이오시스템즈
고순도 RNA 분리 키트 로슈11828665001
역전사 시스템 키트 프로메가A3500
재조합 Taq DNA 중합효소다카라R001ᅡ
프라이머(2μl)시그마
초순수 아가로스 인비트로젠16500-500
100bp 사다리인비트로젠제15628-019
수량 1 4.5.2 (Gel Doc 2000)비오라드Tel.: 170-8100
QIAquick PCR 정제 키트키아젠28106
BigDye Terminator v3.1 사이클 염기서열분석 키트 어플라이드 바이오시스템즈4337455
0.1ml 반응판(MicroAMP Optical 96-well)어플라이드 바이오시스템즈4346906
유전자 분석기 ABI300 어플라이드 바이오시스템즈4346906
DH5α 수용 세포(E. coli)인비트로젠18263-012
pFUSEss-CHIg-hG1 (4493 bp)인비보젠PFUSESS-HCHG1
pFUSEss-CHIg-hG4 (4484 bp) 인비보젠PFUSESS-HCHG4
pFUSE2ss-CLIg-hk (3875 bp)인비보젠PFfuse2SS-HCLK
pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3883 bp) 인비보젠PF유에스2SS-HCLL2
SOC 매체인비트로젠제15544-034
Zeocin(Fast-Media Zeo Agar)이 보충된 LB 기반 한천 배지인비보젠파스-Zn-S
Zeocin(Fast-Media Zeo TB)이 보충된 TB(Terrific Broth) 기반 액체 배지인비보젠FAS-Zn-L
DNA Miniprep 키트 오메가 바이오 테크놀로지D6942-02
Nanodrop (ND1000 분광 광도계)나노드롭
Blasticidin(Fast-Media Blast Agar)이 보충된 LB 기반 한천 배지인비보젠FAS-BL-에스
Blasticidin(Fast-Media Blast TB)이 보충된 TB(Terrific Broth) 기반 액체 배지인비보젠FAS-BL-L
에코RI뉴잉글랜드 바이오랩스R0101S20,000 U/ml, 10x NEBuffer EcoRI
그렇다뉴잉글랜드 바이오랩스R0131S10,000 U/ml, 10x NEBuffer 2.1
2-Log DNA 사다리뉴잉글랜드 바이오랩스N3200S0.1-10.0kb, 1,000μg/ml
엑스마뉴잉글랜드 바이오랩스R0180S10,000U/ml, 10x CutSmart 버퍼
비시위뉴잉글랜드 바이오랩스R0553S10,000 U/ml, 10x NEBuffer 3.1
아브르II뉴잉글랜드 바이오랩스R0174S5,000U/ml, 10x CutSmart 버퍼
FastAP 감열성 알칼리성 인산가수분해효소써모 사이언티픽(Thermo ScientificEF06511U/μL, 10x FastAP 버퍼에서
DH5α 수용 세포 인비트로젠18263-012
PE 마우스 안티 휴먼 IgGBD 파밍겐555787
anti-CD22, PerCP-Cy5.5, 클론: HIB22피셔 사이언티픽BDB563942
QIAprep Spin Miniprep 키트 키아젠27106
BigDye 터미네이터 v3.1어플라이드 바이오시스템즈4337455
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