모든 동물 모델 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 동물 면역
- 생후 6-8주 된 암컷 BALB/c 마우스에 50μg의 APN 단백질 또는 인산염 완충 식염수(PBS, 음성 대조군)를 보조제와 혼합하여 2주에 한 번 피하주사합니다. 초기 면역에는 열에 의해 살해된 마이코박테리아(Mycobacteria)가 포함된 완전한 프로인드 보조제(Freund's adjuvant)를 사용하고, 부스터 면역에는 불완전한 프로인드 보조제(Incomplete Freund's adjuvant)를 사용합니다. APN 단백질(또는 PBS)과 Freund's adjuvant 또는 incomplete Freund's adjuvant를 각각 동일한 부피로 혼합합니다.
- 0.05M PBS(pH 9.6)에 희석된 5μg/mL APN 단백질로 코팅된 마이크로타이터 플레이트를 사용하여 간접 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 이러한 마우스의 혈청에서 APN에 대한 항체 역가를 검출합니다.
2. APN에 대한 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 기술
- 최종 항원 부스트를 위해 선택한 마우스에 100μg의 APN 단백질을 복강내(i.p.) 주입합니다.
- 3일 후, 펜토바르비탈 나트륨(50mg/kg, v/v, 복강내)과 자궁경부 탈구를 사용하여 쥐를 안락사시킵니다.
- 비장을 채취하고 DMEM으로 두 번 씻어 혈액과 지방 세포를 제거합니다. 200메시 구리 그리드를 사용하여 비장 세포 현탁액을 여과하여 조직 파편을 제거하고 원심분리(1500 × g, 10분)를 사용하여 비장 세포를 채취하여 비장 막을 제거합니다.
- 6% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 5mL의 Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM)을 함유한 25cm2 플라스크에 마우스 골수종 SP2/0 세포를 종자하고 세포 생존력을 유지하기 위해 37°C, 6% CO2 분위기에서 배양합니다. 배양 5-6일 후, 세포는 소생술 후 80%-90% 합류점에 도달하고 성장 로그 단계에 있습니다. 현미경으로 보면 세포는 둥글고 밝고 투명합니다.
- 교잡하기 하루 전, 이전에 발표된 방법에 따라 마우스의 복막강에서 대식세포를 수집합니다.
- 복막 대식세포를 100μL의 HAT 배지(10% FBS 및 1x HAT 보충제로 보충된 DMEM)를 포함하는 96웰 플레이트에 0.1-0.2 × 105/mL의 밀도로 파종하고 37°C, 6% CO2 가습 대기에서 밤새 배양합니다.
- 혼성화를 위해 8-10병의 피펫으로 SP2/0 세포를 부드럽게 흡인하고 10mL의 무혈청 DMEM 배지에 현탁합니다. 새 DMEM, 원심분리기(1500 × g, 10분)로 세포를 두 번 세척한 다음 10mL의 DMEM에 다시 현탁합니다.
- 정량화된 비장 세포를 SP2/0 세포와 10:1의 비율로 혼합하고 50mL 튜브로 옮깁니다. 원심분리기(1500×g, 10분)를 버리고 상층액을 버립니다. 튜브 바닥에 있는 세포 펠릿을 모으고 손바닥으로 두드려 혼성화 전에 펠릿을 느슨
하게 합니다.
- 37°C로 예열한 폴리에틸렌 글리콜 1500(PEG 1500) 1mL를 스포이드를 사용하여 튜브 바닥을 부드럽게 회전시키면서 45초의 시간 동안 느슨해진 셀 펠릿에 적가합니다.
- 37°C로 예열된 DMEM 1mL를 90초 동안 위의 혼합물에 천천히 첨가한 다음 새로운 DMEM 30mL를 더 첨가합니다. 융합 튜브를 37°C 수조에 30분 동안 넣습니다.
- 따뜻한 목욕에서 배양 후 세포를 수확하고 HAT 배지에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 복막 대식세포를 접종한 96웰 플레이트에서 배양합니다.
- 5일 후, 각 웰에 100μL의 신선한 HAT 배지를 추가하고 추가로 5일 동안 플레이트를 배양한 후 배지를 HT 배지(10% FBS 및 1x HT 보충제가 보충된 DMEM)로 교체합니다.
- 0.05M PBS(pH 9.6)로 희석된 5μg/mL APN 단백질로 코팅된 마이크로타이터 플레이트를 사용하여 ELISA 분석을 통해 하이브리도마 상등액의 단클론 항체를 분석합니다.
- 96웰 플레이트의 웰에 있는 배지가 황색으로 변하거나(세포 성장 및 대사 산물 방출로 인해 배지의 pH가 6.8로 감소하고 페놀 빨간색이 자홍색에서 노란색으로 변함) 세포 클러스터가 관찰되면 선택한 웰에서 100μL 상층액을 획득하고 코팅된 ELISA 플레이트의 웰에 추가합니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 OD450 값을 측정합니다.
- APN 및 비감염 마우스 혈청에 대한 다클론 항체를 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용하고 PBS를 빈 대조군으로 사용합니다. 본 연구에서는 2.1≥ 표본 대 음성 대조군의 OD450 비율이 양성 선택 기준으로 인정되었습니다.
