메탈로펩티다아제에 대한 재조합 항체를 생산하는 방법

초록

출처: Xia, P. et al., 돼지 장 점막 상피에서 아미노펩티다아제 N을 표적으로 하는 단클론 항체 생산.J. Vis. 특급(2021년)

이 비디오는 메탈로펩티다아제에 대한 재조합 항체 생산 절차를 보여줍니다. 항체, 녹색 형광 단백질 및 항생제 내성에 대한 유전자를 운반하는 재조합 플라스미드는 리포펙타민을 사용하여 상피 세포로 transfection됩니다. 형질주입된 세포를 선택하고 배양하여 재조합 항체를 생성합니다.

프로토콜

1. 돼지 아미노펩티다아제 N(APN) 단백질 항원의 제조

참고: pET28a(+)-APN-BL21(DE3) 균주 및 APN 안정적으로 발현된 세포 pEGFP-C1-APN-IPEC-J2는 이전 연구에서 구성되었습니다.

1. 단일 콜로니 분리를 위해 50μg/mL 카나마이신(Km⁺)을 함유한 Luria-Bertani(LB) 플레이트에 동결된 글리세롤 스톡과 줄무늬에서 박테리아를 회수합니다.
2. 갓 줄무늬를 만든 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 Km⁺(50μg/mL)가 보충된 4mL의 LB 배지(10g/L 트립톤, 10g/L 염화나트륨(NaCl) 및 5g/L 효모 추출물, pH 7.2)에서 배양한 다음 37°C에서 교반(178rpm)으로 하룻밤(12-16시간) 성장하도록 둡니다.
3. 준비된 박테리아를 신선한 Km⁺ LB 육수에 1:100에 희석하고 OD₆₀₀이 0.4-0.6에 도달할 때까지 2-3시간 동안 흔들면서 37°C에서 배양합니다.
4. 배지에 이소프로필 β-d-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 최종 농도 0.4mM까지 첨가하고 16°C에서 추가로 10시간 동안 배양물을 배양합니다.
5. 따라서 IPTG 유도(10,000 × g, 4 °C 15 분)를 사용하여 박테리아를 원심분리하고 수확합니다.
6. 1mg/mL 라이소자임을 함유한 5mL의 LEW(Lysis/Equilibration/Wash) 완충액(50mM 무수 인산나트륨 일염기성(NaH₂PO₄) 및 300mM NaCl, pH 8.0)을 사용하여 세포 펠렛을 재현탁합니다. 얼음에서 박테리아 현탁액을 30분 동안 저어주고 초음파 균질기를 사용하여 완전히 초음파 처리합니다(15초 펄스 및 20초 꺼짐, 15분).
7. 조세포 용해물을 4°C, 10,000×g에서 30분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. 상층액을 사전 평형 컬럼으로 옮기고 중력 배수 1-2분 전에 배양합니다. 이 단계를 세 번 반복합니다.
8. 20mL의 LEW 버퍼를 사용하여 컬럼을 세척하고 중력을 사용하여 배출합니다. 9mL의 용출 완충액(50mM_NaH2PO₄, 300mM NaCl 및 250mM 이미다졸, pH 8.0)을 사용하여 히스티딘 태그가 지정된 APN 단백질을 용리하고 투석 튜브에 수집합니다.
9. 탄산나트륨-중탄산나트륨(인산염 완충 식염수(PBS), 135mM NaCl, 4.7mM 염화칼륨, 2mM NaH₂PO₄ 및 10mM 도데카하이드레이트 인산나트륨 이염기성, pH 7.2) 완충액에서 4°C에서 단백질 용액을 밤새 투석합니다.
10. 12.0% SDS-PAGE 겔과 웨스턴 블로팅을 사용하여 APN 단백질의 순도를 평가합니다.
    1. 겔의 각 웰에 5μg의 단백질을 로드하고 110V에서 1.5시간 동안 작동시킵니다. 그런 다음 15V에서 50분 동안 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 옮기고 BCA(bicinchoninic acid) 분석을 사용하여 정제된 단백질의 농도를 측정합니다.

2. 동물 면역

1. 생후 6-8주 된 암컷 BALB/c 마우스에 50μg의 APN 단백질 또는 PBS(음성 대조군)를 2주에 한 번 보조제와 혼합하여 피하(s.c) 주사합니다. 초기 면역에는 열에 의해 살해된 마이코박테리아(Mycobacteria)가 포함된 완전한 프로인드 보조제(Freund's adjuvant)를 사용하고, 부스터 면역에는 불완전한 프로인드 보조제(Incomplete Freund's adjuvant)를 사용합니다. APN 단백질(또는 PBS)과 Freund's adjuvant 또는 incomplete Freund's adjuvant를 각각 동일한 부피로 혼합합니다.
2. 0.05M PBS(pH 9.6)에 희석된 5μg/mL APN 단백질로 코팅된 마이크로타이터 플레이트를 사용하여 간접 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 이러한 마우스의 혈청에서 APN에 대한 항체 역가를 검출합니다.

3. APN에 대한 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 기술

1. 최종 항원 부스트를 위해 선택한 마우스에 100μg의 APN 단백질을 복강내(i.p.) 주입합니다.
2. 3일 후, 펜토바르비탈 나트륨(50mg/kg, v/v, 복강내)과 자궁경부 탈구를 사용하여 쥐를 안락사시킵니다.
3. 비장을 채취하고 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)으로 두 번 세척하여 혈액과 지방 세포를 제거합니다. 200메시 구리 그리드를 사용하여 비장 세포 현탁액을 여과하여 조직 파편을 제거하고 원심분리(1500 × g, 10분)를 사용하여 비장 세포를 채취하여 비장 막을 제거합니다.
4. 6% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 5mL의 DMEM을 함유한 25cm² 플라스크에 종자 마우스 골수종 SP2/0 세포를 넣고 세포 생존력을 유지하기 위해 37°C, 6% 이산화탄소(CO₂) 분위기에서 배양합니다. 배양 5-6일 후, 세포는 소생술 후 80%-90% 합류점에 도달하고 성장 로그 단계에 있습니다. 현미경으로 보면 세포는 둥글고 밝고 투명합니다.
5. 교잡하기 하루 전, 이전에 발표된 방법에 따라 마우스의 복막강에서 대식세포를 수집합니다.
6. 100μL의 하이포잔틴-아미노옵테린-티미딘(HAT) 배지(DMEM에 10% FBS 및 1x HAT 보충제)를 포함하는 96웰 플레이트에 0.1-0.2 × 10⁵/mL의 밀도로 복막 대식세포를 파종하고 37°C, 6% CO₂ 가습 대기에서 밤새 배양합니다.
7. 혼성화를 위해 8-10병의 피펫으로 SP2/0 세포를 부드럽게 흡인하고 10mL의 무혈청 DMEM 배지에 현탁합니다. 새 DMEM, 원심분리기(1500 × g, 10분)로 세포를 두 번 세척한 다음 10mL의 DMEM에 다시 현탁합니다.
8. 정량화된 비장 세포를 SP2/0 세포와 10:1의 비율로 혼합하고 50mL 튜브로 옮깁니다. 원심분리기(1500×g, 10분)를 버리고 상층액을 버립니다. 튜브 바닥에 있는 세포 펠릿을 모으고 손바닥으로 두드려 혼성화 전에 펠릿을 느슨
하게 합니다.
9. 37°C로 예열한 폴리에틸렌 글리콜 1500(PEG 1500) 1mL를 스포이드를 사용하여 튜브 바닥을 부드럽게 회전시키면서 45초의 시간 동안 느슨해진 셀 펠릿에 적가합니다.
10. 37°C로 예열된 DMEM 1mL를 90초 동안 위의 혼합물에 천천히 첨가한 다음 새로운 DMEM 30mL를 더 첨가합니다. 융합 튜브를 37°C 수조에 30분 동안 넣습니다.
11. 따뜻한 목욕에서 배양 후 세포를 수확하고 HAT 배지에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 복막 대식세포를 접종한 96웰 플레이트에서 배양합니다.
12. 5일 후, 각 웰에 100μL의 신선한 HAT 배지를 추가하고 추가로 5일 동안 플레이트를 배양한 후 배지를 HT 배지(10% FBS 및 1x HT 보충제가 보충된 DMEM)로 교체합니다.
13. 0.05M PBS(pH 9.6)로 희석된 5μg/mL APN 단백질로 코팅된 마이크로타이터 플레이트를 사용하여 ELISA 분석을 통해 하이브리도마 상등액의 단클론 항체를 분석합니다.
    1. 96웰 플레이트의 웰에 있는 배지가 황색으로 변하거나(세포 성장 및 대사 산물 방출로 인해 배지의 pH가 6.8로 감소하고 페놀 빨간색이 자홍색에서 노란색으로 변함) 세포 클러스터가 관찰되면 선택한 웰에서 100μL 상층액을 획득하고 코팅된 ELISA 플레이트의 웰에 추가합니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 광학 밀도 450(OD450) 값을 측정합니다.
    2. APN 및 비감염 마우스 혈청에 대한 다클론 항체를 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용하고 PBS를 빈 대조군으로 사용합니다. 본 연구에서는 2.1≥ 표본 대 음성 대조군의 OD450 비율이 양성 선택 기준으로 인정되었습니다.
14. 3회 연속 positive selection round 후, 제한된 희석 분석을 위해 APN 단백질에 대해 증가된 혈청 반응을 보이는 hybridoma를 선택합니다.
    1. 복막 대식세포를 준비하고 앞에서 설명한 대로 96웰 플레이트에 씨앗을 뿌립니다.
    2. HT 배지에서 웰당 평균 0.5-2 세포로 하이브리도마 세포를 현탁시키고 37 °C, 6% CO₂ 인큐베이터에서 배양합니다. ELISA 면역분석법에서 나타난 양성률이 100%에 도달할 때까지 이 단계를 3-4회 반복합니다.
15. 지속적인 동결 및 해동의 압력 하에서 항APN 항체를 안정적으로 분비하고 정상적으로 증식할 수 있는 양성 하이브리도마 세포를 선택합니다.
    1. 각 마우스에 0.3mL의 pristane을 1회 주사합니다(8-10주). 프리스틴을 투여받은 후 10일째에 각 마우스에 0.5mL의 PBS(pH 7.2)에 2-5 x 10⁵ 하이브리도마 세포를 주입합니다.
    2. 주사 후 8-10일 후에 이 마우스의 복강에서 복막액을 조심스럽게 채취하십시오.
    3. 5,000 × g에서 15 분 동안 원심 분리하여 상층액을 수확하고 33 % 포화 황산 암모늄 [(NH₄) ₂SO₄] 침전 및 단백질 A 아가로 스를 사용하여 상등액의 항체를 정제합니다.

4. APN 단백질에 대한 단클론 항체(mAb)의 특성 분석

1. SBA Clonotyping System-HRP를 사용하여 수집된 mAb의 면역글로불린 아형을 측정합니다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅을 사용하여 mAb 순도 및 특이성을 평가합니다.
2. ELISA를 사용하여 APN 단백질에 대한 mAb 항원결정기 특이성을 분석합니다.가산성 값(AV)은 OD_mAbs(a+b)와 (OD_mAbs-a+OD_mAbs-b)의 비율로, mAb가 동일한 항원 부위를 인식하는지 여부를 평가하는 데 사용됩니다. OD_mAbs-a 및 OD_mAbs-b는 APN 단독에 대한 서로 다른 단클론 항체의 OD450 값을 나타내고, OD_mAbs(a+b)는 APN에 대한 두 mAb의 1:1 혼합의 OD450 값을 나타냅니다.
   1. 각 샘플을 최소 4회 반복하여 평가하고 전체 실험을 최소 3회 반복합니다.

5. APN에 대한 rAb의 표현

1. 위에서 언급한 APN 면역 마우스의 하이브리도마 세포와 비장에서 총 RNA를 추출합니다(예: TRIzol). 제조업체의 지침에 따라 cDNA 합성 키트를 사용하여 상보적 DNA(cDNA)를 합성합니다.
2. 중첩 중합효소연쇄반응(PCR)을 사용하여 mAb의 가변 영역을 증폭하고 염기서열분석을 사용하여 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) 염기서열을 측정할 수 있습니다. IMGT 마우스 게놈 분석 툴(http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php)을 사용하여 VH 및 VL을 인코딩하는 유전자를 분석합니다.
3. VH 및 VL 유전자를 리더 염기서열과 결합하고 원활한 클로닝 기술을 사용하여 각각 pET28a(+) 및 pIRES2-ZsGreen1 벡터에 순차적으로 subclone하여 흉터 없는 DNA 단편을 삽입할 수 있습니다. 구체적인 프라이머는 표 1에 나열되어 있습니다.
4. 37°C에서 10시간 동안 0.4mM IPTG의 존재 하에서 pET28a(+)-rAbs-APN-BL21 형질전환균을 성장시킵니다. 그런 다음 일상적인 단백질 정제를 사용하여 rAbs 단백질의 발현을 유도, 정제 및 평가합니다.
5. 웰당 100 μL 0.5 x 10⁵ CHO 세포를 96-well 플레이트에 시딩하고 37 °C에서 6% CO₂ 분위기에서 18-24시간 동안 배양합니다. 세포가 80-90% confluence에 도달하면 pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN 플라스미드를 Opti-MEM으로 최종 농도 0.1μg/μL로 희석하고 실온에서 5분 후 배양한 후 transfection에 사용합니다.
6. 희석된 pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN 플라스미드 50μL를 1μL의 Lipofectamine 2000 및 49μL의 Opti-MEM과 부드럽게 혼합하고 혼합물을 실온에서 추가로 20분 동안 배양합니다. CHO 세포를 포함하는 96웰 플레이트의 각 웰에 혼합물 100μL를 추가하고 37°C에서 6% CO₂ 분위기에서 4-6시간 동안 배양합니다.
7. transfection 후 4-6시간에 배지를 10% FBS가 보충된 DMEM-F12 배지로 교체하고 플레이트를 다시 48시간 동안 배양합니다. 그런 다음 각 웰에 400μg/mL G418을 첨가하여 안정적으로 transfection된 세포를 선택합니다.
8. 10% FBS 및 400 μg/mL G418이 보충된 DMEM-F12 배지를 사용하여 10일 동안 선별한 후 형광 활성화 세포 분류로 세포(3.0 × 10⁷ cells/mL)를 선별합니다. 세포 집단의 약 10-15%가 양성이었습니다.
9. 수확된 양성 세포를 연속적으로 희석하고, 96웰 플레이트에서 웰당 평균 0.5-2개의 세포로 파종하고, 37°C, 6% CO₂ 인큐베이터에서 배양합니다. G418(200μg/mL)을 사용하여 안정적으로 transfection된 pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO 세포를 유지합니다.
10. 상술한 세포-배양 배지 내의 FBS 농도는 3주에 걸친 로그 성장 단계 동안 10%에서 0%로 점진적으로 감소한다. 그런 다음, 부착된 CHO 세포를 무혈청 배지에서 현탁액 성장에 적응시킵니다.
11. 80-110 rpm 진탕 속도 및 37°C, 6% CO₂의 진탕 플라스크에서 0.8-1.0 × 10⁵ cells/mL의 밀도로 혈청이 없는 배지의 로그 성장 단계에서 파종된 pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO 세포를 배양합니다.
12. 12시간마다 세포 현탁액을 수집하여 제조업체의 지침에 따라 세포 계수 키트(예: CCK-8)를 사용하여 세포 생존율 및 활력의 변화를 측정합니다.
13. 항체 발현은 세포 생존율이 80%로 감소하고 세포 밀도가 1.0-2.0 × 10⁶ cells/mL에 도달할 때 최고 수준에 도달합니다. 원심분리를 사용하여 세포 상층액을 수확하고, 0.22μm 폴리테트라플루오로에틸렌 멤브레인 필터를 사용하여 필터링하고, 단백질 A 아가로스를 사용하여 정제합니다.
14. 간접 면역형광 분석법(IFA)을 사용하여 APN 특이적 항체 생산을 확인합니다.
15. 앞서 설명한 대로 ELISA 분석을 사용하여 항체 역가와 결합 친화도를 측정합니다.소프트웨어를 사용하여 4개의 파라미터 로지스틱 방정식으로 항체의 평형 해리 상수(K_D 값)를 계산합니다.

표 1. 이 연구에 사용된 특정 프라이머.

트

입문서	시퀀스 (5'-3')
VH-VL-F	CCGGGTGGGCCGGATAGACM개그
VH-VL-R	CCGGCCACATAGGCCCCACTTGACATTGATGT
pET28a (+)-F	TCCACCAGTCATGCTAGCCATAACAACACGGTCGTGATTCGA
pET28a (+)-R	CTGGTGCCGCGCGGCAGTGGGATACCCGTATTACCC
pIRES2-Zs녹색1-F	CGACGGTACCGCGGGCCCGGTAACAACGGTCGTGATTCGA
pIRES2-Zs녹색1-R	GGGGGGAGGGAG가그타카카그타카치

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
프로인트의 보조제 완료	시그마-알드리치	F5881	동물 면역 접종
다피	Beyotime 생명공학	C1002 (영문	핵 counterstain
DMEM을 참조하십시오.	지브코	11965092	세포 배양
DMEM-F12	지브코	12634010	세포 배양
Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG 2차 항체	애브킨	A23310	간접 면역형광 분석
향상된 세포 계수 키트-8	Beyotime 생명공학	C0042	세포 생존율 및 활력 측정
소 태아 세럼	지브코	10091	세포 배양
유전학™ 선택적 항생제	지브코	11811098	선택적 항생제
HAT 보충제 (50X)	지브코	21060017	셀 선택
HT 보충제 (100X)	지브코	11067030	셀 선택
불완전한 프로인트 보조제	시그마-알드리치	F5506	동물 면역 접종
이소 프로필 β-d-1- 티오 갈 락토 피라 노사이드	시그마-알드리치	I5502	단백질 발현
카나마이신	Beyotime 생명공학	ST102	살균 항생제
Leica TCS SP8 STED 컨포칼 현미경	라이카 마이크로시스템즈	SP8 표준	형광 이미징
Lipofectamine® 2000 시약	써모피셔	11668019	형질주입(Transfection)
LSRFortessa™ 형광 활성화 세포 분류	BD (영어)	FACS LSR포르테사	유세포 분석
마이크로플레이트 리더	(주)바이오텍	상자 998	ELISA 분석
마이크로 분광 광도계	써모 피셔	나노 드롭 원	핵산 농도 검출
염화나트륨	Sinopharm 화학 시약	10019308	문화 국물
(NH4)2SO4	Sinopharm 화학 시약	10002917	문화 국물
옵티-MEM	지브코	31985088	세포 배양
폴리에틸렌 글리콜 1500	로슈진단	10783641001	세포 융합
PrimeScript™ 1st strand cDNA 합성 키트	Takara Bio (다카라 바이오	RR047	qPCR
단백질 A 아가로스	Beyotime 생명공학	2006쪽	항체 단백질 정제
Protino® Ni+-TED 2000 패킹 컬럼	매셰리-나겔	745120.5	단백질 정제
SBA 클로노타이핑 시스템-HRP	서던 바이오텍	5 월 00	마우스 단클론 항체의 동형분석(Isotyping of mouse monoclonal antibody
Seamless 클로닝 키트	Beyotime 생명공학	D7010S	플라스미드의 구성
플라스크를 흔듭	Beyotime 생명공학	E3285	세포 배양
탄산나트륨 - 중탄산나트륨 완충액	Beyotime 생명공학	C0221ᅡ	세포 배양
Trans-Blot SD 반건조 전사 셀	바이오 라드	170-3940	웨스턴 블롯
트립톤	옥소이드	LP0042	문화 국물
초음파 균질화기	닝보 Xinzhi 생명 공학	JY92-IIN	시료 균질화
효모 추출물	옥소이드	LP0021	문화 국물
96웰 마이크로플레이트	코 닝	3599	세포 배양

) 년 ) 일 ) 니다 년 년