항체에 의한 Fc 수용체 활성화를 연구하기 위한 In Vitro Artificial Activation Assay

초록

출처: Petriello, A. et al. 치료용 항체의 존재 하에서 FcγRIIIa 참여에 의해 주도되는 인간 자연 살해 세포 사건의 평가. J. Vis. 특급 (2020년)

이 비디오는 인간 자연 살해 세포에서 치료 항체에 의해 시작된 FcγRIIIa 주도 이벤트를 보여줍니다. 인공 자극 플랫폼은 세포골격 재배열, 탈과립화, 케모카인/사이토카인 생산 및 결합에 관여하는 항체의 FcγRIIIa 및 Fc 부분에 의해 매개되는 신호 경로를 포함하는 다운스트림 효과기 기능의 탐색을 용이하게 합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. PBMC의 분리 및 NK 세포의 농축/정제

참고: 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 분리 및 농축/정제를 위한 다른 방법도 수행할 수 있습니다.

1. 규제된 조건에서 헤파린이 들어 있는 튜브에 200mL의 혈액을 추출합니다.
2. 15mL의 밀도 구배 배지를 다공성 장벽이 통합된 50mL 튜브에 추가합니다. 튜브를 1000 x g에서 30초 동안 돌립니다.
3. 튜브에 혈액 12.5mL를 넣은 다음 PBS 12.5mL를 더 넣고 부드럽게 3회 뒤집습니다. 800 x g에서 실온(RT)에서 15분 동안 중단 없이 튜브를 돌립니다.
4. 세포가 회전하는 동안 다공성 장벽이 있는 각 튜브에 대해 40mL의 PBS가 있는 50mL 원뿔형 튜브를 준비합니다.
5. 튜브를 조심스럽게 제거하고 원심분리 후 검사합니다. 50mL 튜브의 20mL와 25mL 경계 사이에 다공성 장벽 위에 얇고 눈에 띄게 흰색인 PBMC 층이 있는지 확인합니다.....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
파라포름알데히드 16%	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	전화: 50-980-487
알렉사 플루어 488 팔로이딘	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	A12379
anti-mouse HRP 항체	세포 신호 전달 기술	7076
AutoMACS 기기	밀테니		NK 세포 분리 방법; 다른 분리 기기를 사용할 수 있습니다.
CD107a APC 항체	바이오레전드	328620
소 혈청 알부민 분획 V, 지방산 무함유	밀리포어 시그마	10775835001
사이토카인 30-Plex 인간 패널	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	LHC6003M	케모카인/사이토카인 방법; 다른 케모카인/사이토카인 분석 방법이 사용될 수 있습니다.
FBS (소태아 혈청)	하이클론	SH30071.01
염소 안티 휴먼 κ 라이트 체인 항체	밀리포어 시그마	AP502
프로테아제(Protease) 및 포스파타아제 억제제(Phosphatase Inhibitor) 칵테일 중단	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	78440
pAKT (S473) 항체	세포 신호 전달 기술
pERK1/2 항체	세포 신호 전달 기술
pPRAS40 항체	세포 신호 전달 기술	13175
β-actin HRP 항체	아브캠	AB6721
NK 세포 분리 키트	밀테니	Tel.: 130-092-657	NK cell isolation kit; 다른 isolation kit가 사용될 수 있습니다.

) ) ) 시리즈 ) 년