항체에 의한 Fc 수용체 활성화를 연구하기 위한 In Vitro Artificial Activation Assay

초록

출처: Petriello, A. et al. 치료용 항체의 존재 하에서 FcγRIIIa 참여에 의해 주도되는 인간 자연 살해 세포 사건의 평가. J. Vis. 특급 (2020년)

이 비디오는 인간 자연 살해 세포에서 치료 항체에 의해 시작된 FcγRIIIa 주도 이벤트를 보여줍니다. 인공 자극 플랫폼은 세포골격 재배열, 탈과립화, 케모카인/사이토카인 생산 및 결합에 관여하는 항체의 FcγRIIIa 및 Fc 부분에 의해 매개되는 신호 경로를 포함하는 다운스트림 효과기 기능의 탐색을 용이하게 합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. PBMC의 분리 및 NK 세포의 농축/정제

참고: 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 분리 및 농축/정제를 위한 다른 방법도 수행할 수 있습니다.

1. 규제된 조건에서 헤파린이 들어 있는 튜브에 200mL의 혈액을 추출합니다.
2. 15mL의 밀도 구배 배지를 다공성 장벽이 통합된 50mL 튜브에 추가합니다. 튜브를 1000 x g에서 30초 동안 돌립니다.
3. 튜브에 혈액 12.5mL를 넣은 다음 PBS 12.5mL를 더 넣고 부드럽게 3회 뒤집습니다. 800 x g에서 실온(RT)에서 15분 동안 중단 없이 튜브를 돌립니다.
4. 세포가 회전하는 동안 다공성 장벽이 있는 각 튜브에 대해 40mL의 PBS가 있는 50mL 원뿔형 튜브를 준비합니다.
5. 튜브를 조심스럽게 제거하고 원심분리 후 검사합니다. 50mL 튜브의 20mL와 25mL 경계 사이에 다공성 장벽 위에 얇고 눈에 띄게 흰색인 PBMC 층이 있는지 확인합니다.
6. 얇고 하얀 PBMC 층을 방해하지 않고 피펫을 사용하여 상단에서 가능한 한 많은 액체를 조심스럽게 제거합니다.
7. 깨끗한 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 투명하고 황색을 띤 액체 층과 함께 PBMC 층을 튜브 필터까지 부드럽게 제거합니다.
8. 1.4단계에서 준비한 PBS가 함유된 50mL 원뿔형 용액으로 PBMC와 액체를 배출합니다. 실온과 300 x g에서 5분 동안 튜브를 돌립니다.
9. PBS 세척을 흡인하고 PBS 40mL를 추가합니다. 실온과 300 x g에서 5분 동안 튜브를 돌립니다.
10. 세척 후 세포를 계수하고 1 x 10⁷ 세포당 2% BSA/PBS 40μL에 재현탁합니다.
11. 선택한 방법을 사용하여 NK 세포의 분리를 진행합니다. 선택 사항에는 수동 또는 자동 마그네틱 비드 기반 분류가 포함됩니다. 형광 활성화 세포 분류도 수행할 수 있습니다.
12. 유세포 분석으로 NK cell의 순도를 측정하기 위해 세포의 작은 부분 표본을 제거합니다. 게이팅 전략에는 다음이 포함됩니다: forward vs. side scatter profile을 기반으로 살아있는 세포를 게이트한 다음 특정 살아있는 모집단의 NK 마커(예: CD3, CD56)를 기반으로 순도를 평가합니다. 일반적인 순도는 >95%입니다.
13. 분리가 완료된 후 RT 및 300 x g에서 5분 동안 셀을 스핀하여 펠릿 및 흡인합니다.
14. 영양소, 10% 열 비활성화 FBS, 1mM 피루브산 나트륨, 55mM 2-ME 및 10mM HEPES(pH = 7.2)를 사용하여 RPMI 1640에서 세포 펠릿을 1 x 10⁷ cells/mL로 재현탁합니다.

2. FcγRIIIa를 통한 NK 세포의 항체 매개 활성화

1. 냉장 마이크로 원심분리기를 4°C로 설정합니다.
2. 1 x 10⁶ (100 μL of)의 부유 NK 세포를 1.5 mL 튜브에 분주하고 얼음 위에 놓습니다.
   메모: 샘플이 많은 경우 셀을 96웰 U-바닥 플레이트에 분배할 수 있습니다.
3. 샘플당 1μL의 100μg/mL 리툭시맙(또는 관심 항체)을 준비하고 세포에 1μL를 추가하여 최종 농도 1μg/mL 항체를 얻습니다.
   메모: 조합 효과의 평가를 위해 이 시점 또는 그 이전에 다른 분자를 세포에 추가할 수 있습니다. 여기서, 리틱수맙은 자극을 위해 사용되었다. 이전 연구에서는 소분자 억제제가 자극에 추가되었습니다.
4. 샘플을 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 배양 중에 배지에서 샘플당 50μL의 50μg/mL 항인간 κ 경쇄 항체를 준비하고 가열 블록 또는 수조에서 37°C로 예열합니다.
5. 얼음에서 세포를 배양한 후 1mL의 얼음처럼 차가운 배지를 추가하고 4°C에서 5분 동안 135 x g에서 회전합니다.1mL의 얼음처럼 차가운 배지로 다시 세척합니다.
6. 마지막 세척 후 상등액을 흡인하고 2.4단계에서 제조한 항-인간 κ 경쇄 혼합물 50μL를 첨가합니다.
7. 최종 사용자가 결정한 시점의 샘플을 37°C의 열 블록 또는 수조에서 즉시 배양합니다.
8. 1mL의 얼음처럼 차가운 매체를 추가하여 자극을 중지하고 135 x g의 냉장 원심분리기에서 5분 동안 샘플을 즉시 회전시킵니다. 1mL의 얼음처럼 차가운 매체로 한 번 더 세척합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
파라포름알데히드 16%	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	전화: 50-980-487
알렉사 플루어 488 팔로이딘	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	A12379
anti-mouse HRP 항체	세포 신호 전달 기술	7076
AutoMACS 기기	밀테니		NK 세포 분리 방법; 다른 분리 기기를 사용할 수 있습니다.
CD107a APC 항체	바이오레전드	328620
소 혈청 알부민 분획 V, 지방산 무함유	밀리포어 시그마	10775835001
사이토카인 30-Plex 인간 패널	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	LHC6003M	케모카인/사이토카인 방법; 다른 케모카인/사이토카인 분석 방법이 사용될 수 있습니다.
FBS (소태아 혈청)	하이클론	SH30071.01
염소 안티 휴먼 κ 라이트 체인 항체	밀리포어 시그마	AP502
프로테아제(Protease) 및 포스파타아제 억제제(Phosphatase Inhibitor) 칵테일 중단	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	78440
pAKT (S473) 항체	세포 신호 전달 기술
pERK1/2 항체	세포 신호 전달 기술
pPRAS40 항체	세포 신호 전달 기술	13175
β-actin HRP 항체	아브캠	AB6721
NK 세포 분리 키트	밀테니	Tel.: 130-092-657	NK cell isolation kit; 다른 isolation kit가 사용될 수 있습니다.

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