항원 특이적 B 세포에서 단클론 항체를 생성하는 기술

초록

출처: Devilder, M., et al. 혈액 내 순환하는 희귀 항원 특이적 B 세포에서 구별되는 인간 단클론 항체 생성. J. Vis. 특급. (2018).

이 비디오는 항원 특이적 B 세포에서 단클론 항체를 생성하는 기술을 보여줍니다. 분리된 항원 특이적 B 세포에서 복제된 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 진핵생물 발현 벡터는 폴리플렉스를 사용하여 포유류 세포에 도입됩니다. 일단 세포 내부로 들어가면 이러한 벡터는 번역을 거치고, 그 결과로 생성된 중쇄 및 경쇄 펩타이드는 항체로 조립되어 세포에서 분비됩니다.

프로토콜

1. mAb 생산

1. transfection 전날, 200μL의 Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM)에 15,000개의 Human embryonic kidney 293A(HEK 293A) 세포를 파종하고 96-well plate에서 well당 10% FBS를 보충했습니다. 37 ° C의 CO₂ 인큐베이터 (5 % CO₂)에서 밤새 배양하십시오.
2. 선형 폴리에틸레민 유도체를 형질주입 시약으로 사용하여 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지의 Cotransfection 293A 세포.
   메모: transfection을 세 번 수행합니다. 다음 프로토콜은 평평한 바닥 96웰 플레이트의 한 웰에 대한 것입니다.
   1. 0.5μL의 DNA transfection 시약을 10μL의 150mM NaCl로 희석합니다. 0.125μg의 가변 중쇄(vH) 및 0.125μg의 가변 경쇄(vL)를 10μL의 150mM NaCl로 희석합니다. 각 희석을 10초 동안 소용돌이치십시오.
   2. 10 μL DNA 용액에 10 μL 희석된 DNA transfection 시약을 추가합니다. 15초 동안 소용돌이치고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 293A 셀에 20μL 혼합물을 적하 방향으로 추가하고 플레이트를 부드럽게 휘젓면서 혼합합니다.
3. 형질주입 후 16시간 후에 배지를 교체하고 혈청이 없는 배지에서 5일 동안 세포를 배양합니다.
   메모: 혈청이 없는 배지를 사용하여 생성된 항체를 오염시키는 혈청 면역글로불린(Igs)을 방지합니다.
4. 460 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포와 파편을 제거합니다.
5. 멀티 채널 피펫으로 흡입에 의한 상층액을 채취하여 V-bottom 96-well plate로 옮깁니다.
6. 96-well ELISA 플레이트에서 2μg/mL의 최종 농도로 1x를 재구성한 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)/효소 결합 면역흡착 지점(ELISPOT) 코팅 완충액 1x의 웰당 100μL에 4°C에서 관련 Ag를 하룻밤 동안 코팅합니다.
7. 37°C에서 2시간 동안 10% FBS DMEM 매체로 웰을 차단합니다.
8. step 1.5에서 transfection된 293A 세포의 상등액 50μL를 추가하고 RT에서 2시간 동안 배양합니다.
9. 양고추냉이 과산화효소(HRP) 효소에 접합된 항인간 면역글로불린 G 항체(IgG Ab) 100μL를 1μg/mL로 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 50μL 발색 기질(3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘, TMB)을 추가하고 20분 동안 배양합니다.
10. 분광 광도계에서 450nm에서 광학 밀도를 판독합니다.
    메모: ELISA 분석에 의해 밝혀진 특정 mAb는 대규모로 추가로 생산할 수 있으며 인간 IgG에 대한 친화력을 나타내는 단백질 A 컬럼에서 정제할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
HEK 293A 세포주	Thermo Fisher 사이언티픽	R70507
DMEM (1X) Dulbecco의 변형 독수리 배지	생명 기술의 Gibco	21969-035	(+) 4,5g/L D-포도당 0,11g/L 나트륨 피루베이트 (-) L-글루트민
뉴트리도마-SP	로슈	11011375001	100X 콘크
소 태아 세럼 (FBS)	도미니크 뒤처	S1810-500
Jet PEI DNA 형질주입 시약	폴리플러스	101-40
평평한 바닥96웰 플레이트	송골매	353072
V-바닥 96웰 플레이트	Nunc/써모피셔	55142

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