동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 계단 카테터 준비
- 카테터 단계를 위한 용융 실리카 튜브의 준비
- 내경이 0.1mm이고 벽 두께가 0.0325mm 튜빙인 용융 실리카 모세관을 30mm 길이로 자릅니다.
- 튜브에 균열이 있는지 검사하고 마이크로 포지를 사용하여 끝 부분을 열 연마하여 튜브 개구부의 표면이 매끄러운지 확인합니다.
- 금속 바늘에 내부 튜브를 고정하는 것
- 10μL 주사기에 27G 바늘을 장착하고 주사기를 정위 로봇에 놓습니다.
- 로봇을 사용하여 주사기를 딱딱한 표면 위로 움직이고 바늘 끝으로 만집니다. 이 위치는 카테터 단계의 길이를 설정하기 위한 기준 표면 역할을 하기 때문에 소프트웨어에 기록하거나 저장해야 합니다.
- 융합된 실리카 모세관이 바늘 내부에 배치될 수 있도록 바늘을 들어 올립니다.
- 모세관의 20mm가 바늘에서 튀어나오도록 융합된 실리카 모세관을 바늘에 놓습니다.
- 피펫을 사용하여 그림 1과 같이 금속 바늘에서 시작하여 모세관 하단에서 10mm 위로 마무리하여 2μL의 고점도 시아노아크릴레이트 접착제를 모세관 전체에 고르게 펴 바릅니다.
- 정위 로봇을 사용하여 금속 바늘의 끝이 기준 표면에서 1mm 이상이 될 때까지 바늘을 내립니다. 이런 식으로 융합된 실리카 모세관이 금속 바늘에 고정되어 끝에서 1mm 단계를 형성합니다. 단계가 무뎌지지 않도록 금속 바늘 끝에 형성되는 과도한 접착제를 제거하십시오.
- 접착제가 굳을 때까지 15분 정도 기다렸다가 정위 로봇에서 카테터가 있는 주사기를 제거합니다. 현미경으로 카테터 끝을 확인하여 단계에서 과도한 접착제가 모두 제거되었는지 확인합니다.
- 아가로스 블록을 사용한 스텝 카테터 테스트
- 기존 겔 트레이에서 인산염 완충 식염수(PBS)에 0.6% 아가로스 용액을 준비하고 중합될 때까지 기다립니다. 아가로스를 약 20mm x 20mm 블록으로 자릅니다. 사용할 때까지 블록을 PBS에 담그십시오.
- 계단식 카테터 주사기에 10μL의 0.4% 트리판 블루 용액을 수동으로 채웁니다.
- 정위 로봇을 사용하여 0.2μL/분에서 1μL를 분주하여 고정 절차 중 카테터 단계의 밀봉을 평가합니다. 트리판 블루 용액은 카테터 끝에서만 볼 수 있어야 합니다. 종이 티슈로 닦아내십시오.
- 아가로스 블록을 정위 로봇에 배치하고 카테터의 끝이 아가로스 블록의 표면을 기준으로 하도록 로봇을 보정합니다.
- CED에 대한 주입 매개변수를 프로그래밍합니다.
- 주입량이 5μL인 경우 0.2μL/분에서 1μL, 0.5μL/분에서 2μL, 0.8μL/분에서 2μL 단계를 사용합니다. 각 단계의 지속 시간을 비례적으로 변경하여 특정 실험 계획에 따라 최종 주입량을 조정합니다.
- 용액을 쥐 미상 putamen (선조체)에 주입하려면 3.5mm 깊이에서 브레그마에서 정면 1mm, 측면 1.5-2mm 위치에서 주입을 수행하십시오.
- 주사 후 카테터를 2분 동안 제자리에 두었다가 1mm/분으로 후퇴시켜 뇌의 적절한 체액 분산을 보장하고 카테터 제거 중에 주사관을 밀봉합니다.
메모: 모든 매개변수는 특정 정위 로봇에 따라 단일 스크립트로 프로그래밍할 수 있습니다.
- CED 절차를 시작하고 5μL의 트리판 블루 용액을 아가로스 블록에 주입합니다.
- 아가로스에서 트리판 블루 구름의 모양과 카테터 관을 따라 누출 가능성을 평가합니다. 트리판 블루는 타원체 또는 둥근 구름을 형성해야 하며 중심이 카테터 끝 주위이고 직경이 1mm 이상이어야 합니다. 금속 바늘 끝 위로 큰 역류가 보이지 않아야 합니다.
- 새 아가로스 블록을 배치하고 0.2μL/분에서 1μL의 두 번째 주입을 시작하여 아가로스로 인한 카테터의 막힘을 평가합니다. 트리판 블루는 주사 시작 직후 카테터 끝에서 구름을 형성하기 시작해야 합니다.
- 주사기의 잔여 부피가 3μL에 해당하는지 평가합니다. 모든 변형은 카테터 장착 또는 주사기 플런저를 통한 유체 누출을 나타낼 수 있습니다.
- 모든 테스트 주입이 성공적이고, 카테터가 잘 밀봉되고 직선이며, 카테터 팁 이외의 다른 지점에서 트리판 블루 용액이 관찰되지 않으면 트리판 블루의 흔적이 보이지 않을 때까지 탈이온화된 H2O(dH2O)로 카테터를 세척한 다음 70% 에탄올 및 100% 에탄올로 다시 플러시합니다.
- 카테터를 건조한 상태로 보관하십시오.
2. 대류 강화 항체 용액을 쥐 뇌로 전달
참고: 지역 동물 복지 규정에 따라 이 절차를 위해 다양한 유형의 마취제, 진통제 및 항생제를 시행할 수 있습니다. 이 프로토콜은 주사 마취의 사용을 설명합니다. 이소플루란(isoflurane)과 같은 흡입 마취제는 정위 프레임에 코 마스크를 장착하여 사용할 수도 있습니다. 또한 감염 예방을 위해 식수에 항생제를 첨가하는 것이 좋습니다.
- 외과적 설정
- 마취제와 해독제를 준비하십시오. 마우스는 멸균 증류수(dH2O)에 희석된 펜타닐(0.05mg/kg), 미다졸람(5mg/kg) 및 메데토미딘(0.5mg/kg)을 포함하는 3성분 마취를 사용하여 안전하게 마취할 수 있습니다. 멸균 dH2O(첫 번째 해독제)에 플루마제닐(0.5mg/kg)과 부프레노르핀(0.1mg/kg)을 함유한 두 가지 해독제 용액을 사용하여 2단계 웨이크업 절차를 수행합니다. 두 번째는 멸균 dH2O (두 번째 해독제 용액)에 아티파메졸 (2.5 mg / kg)을 가지고 있습니다.
- 멸균 dH2O로 희석된 카프로펜(5.667 mg/kg)을 함유한 진통제를 준비합니다.
- 정위 프레임, 가열 패드 및 정위 로봇의 요소를 청소합니다. 모든 로봇 부품을 손상 위험 없이 청소할 수 있는 것은 아닙니다. 청소 및 사용 준비에 대한 자세한 내용은 로봇 설명서를 참조하십시오.
- 스텝 카테터로 주사기를 조립하고 dH2O, 70% 에탄올 및 100% 에탄올로 여러 번 플러시한 다음 70% 에탄올 및 dH2O로 다시 플러시합니다. 마지막으로, PBS 또는 기타 완충액으로 주사기를 세척하여 두개내 주사(예: 인공 뇌척수액)를 위한 용액을 준비합니다. 시린지 플런저는 시술 중에 부드럽고 자유롭게 움직여야 합니다.
- 정위 프레임으로 정위 로봇 소프트웨어를 보정합니다.
- 로봇 암이 자유롭게 움직이는지, 사출 펌프가 적절하게 연결되어 있는지, 방해 없이 CED 절차를 수행할 수 있는지 확인하여 정위 로봇 소프트웨어를 테스트합니다. 여기에는 로봇 움직임 테스트, 램핑 주입, 2분 대기 단계 확인, 카테터 후퇴 속도 확인이 포함됩니다. 모든 매개변수는 포인트 1.3.5에 설명된 사전 프로그래밍된 CED 절차에 맞아야 합니다.
- 드릴에 드릴 비트를 삽입합니다. 사용하기 전에 드릴 비트를 소독하는 것이 좋습니다.
- PBS 또는 인공 뇌척수액(aCSF)과 같은 기타 완충 용액을 사용하여 항체 용액을 준비합니다. 5μL에 1 - 20 μg의 항체를 단일 CED 절차로 주입할 수 있습니다. 실험을 수행하기 전에 다른 부피와 단백질 양을 테스트해야 합니다. 고점도 용액을 사용하면 카테터가 막힐 수 있습니다.
- 희석된 항체를 주사기에 수동으로 로드합니다.
- 선조체에 CED에 의한 항체 주입
- 마우스의 무게를 측정하고 체중에 따라 3성분 마취 용액을 복막에 주입합니다. 사출 시간을 기록하십시오. 마우스를 가열 패드로 가열된 별도의 케이지로 옮깁니다.
- 쥐를 관찰하여 진정제가 언제 시작되는지 확인하십시오. 쥐가 움직임을 멈추면 수술 중 각막이 건조해지지 않도록 눈에 안과 연고를 바르십시오. 완전 진정은 일반적으로 3액형 마취액 주입 후 10-15분 후에 시작됩니다.
- 핀치 반사 테스트를 사용하여 통증 반응을 확인하여 동물의 완전한 마취를 확인합니다.
- 트리머를 사용하여 머리를 면도하십시오.
- 요오드 용액에 적신 면봉으로 피부를 소독하십시오. 원을 그리며 피부를 세 번 문지릅니다.
- 두개골 정중선을 따라 10mm 피부를 절개하고 메스를 사용하여 눈높이에 마무리합니다.
- 노즈 cl을 사용하여 정위 프레임에 마우스를 고정합니다.amp 그리고 이어바. 두개골 표면이 수평이고 단단히 고정되어 있는지 확인하십시오. 올바른 해부학적 탐색 외에도 드릴링 및 CED 절차 중에 두개골이 기울어지지 않도록 하는 것도 중요합니다.
- 정위 로봇에 주사기를 놓습니다.
- 드릴 비트를 기준점의 카테터 끝과 동기화합니다. 드릴과 주사기의 위치 사이의 관계는 뇌의 원하는 해부학적 영역에서 주입이 수행될 수 있도록 소프트웨어에서 정확하게 결정되어야 합니다.
- 겸자를 사용하여 피부를 수축시키고 두개골 표면의 브레그마를 국소화합니다.
- 드릴 비트 팁을 사용하여 소프트웨어에서 Bregma를 참조하십시오.
- 드릴을 브레그마에서 정면 1mm, 측면 2mm 위치로 이동하고 버 구멍을 뚫습니다. 경막이 손상되지 않도록 주의하십시오.
- 버 구멍 위로 주사기를 움직입니다.
- 주사기에서 0.5–1 μL를 분주하여 카테터에 기포가 남지 않도록 합니다.
- 1.3.5항에 설명된 CED 프로그램을 시작합니다. 두개골 표면에 주입 지점에서 유체 역류의 흔적이 있는지 관찰합니다. 동물의 호흡 속도를 모니터링합니다.
- CED 프로그램이 끝나고 카테터가 뇌에서 제거되면 주입 펌프를 0.2μL/분으로 시작하여 CED 중 카테터 막힘을 확인합니다. 막힘이 발생하지 않으면 카테터 팁에서 주입 혼합물 방울이 즉시 보여야 합니다.
- 카테터를 재사용하거나 보관하기 전에 현미경으로 카테터 단계에 손상이나 마모 징후가 있는지 육안으로 검사하고 1.3.10단계와 같이 청소하십시오.
