미세아교세포에 의한 타우 단백질 흡수를 평가하기 위한 세포 기반 분석

1. BV-2 미세아교세포 배양

참고: Biosafety Level 2 격납 하에서 BV-2 세포를 처리합니다. BV-2 세포주는 외피를 가진 재조합 친환경성 레트로바이러스(쥐 세포만 감염시킬 수 있음)를 생성합니다. 이러한 바이러스는 체외 형질전환 능력과 생체 내 종양 발생 가능성으로 알려져 있습니다.

1. 10% 소 태아 혈청(FBS), 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민(지금부터 배양 배지라고 함)이 보충된 고포도당 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)에서 BV-2 세포를 4 x 10⁴ cells/mL로 시딩하여 배양합니다.
2. 37 ° C에서 5 % CO₂ 의 가습 된 분위기에서 배양을 유지하십시오 .
   참고: 세포는 느슨하게 부착되어 현탁 상태로 자랍니다.

2. pH에 민감한 형광 염료를 사용한 라벨 재조합 타우 응집체

참고: 타우 응집체는 Apetri et al.에 기술된 대로 준비되었습니다.반응 완충액에 티오플라빈 T(ThT)가 첨가되지 않았다는 차이점이 있습니다. 응집된 샘플은 1.5mL 원심분리 튜브에 수집되었습니다. 최종 형광 신호는 118 μL의 풀 샘플과 12 μL의 50 μM ThT 용액을 혼합하여 검사하였다. 응집체 반응 혼합물을 20,000 x g에서 4°C에서 1시간 동안 원심분리하여 응집체를 분리했습니다. SEC-MALS로 상층액을 분석하여 모든 단량체 타우가 응집체로 전환되었음을 확인했습니다. 펠릿(타우 응집체)을 스냅 프로어링하여 -80°C의 냉동고에 보관했습니다.

1. pH 8.5에서 0.1M 중탄산나트륨 완충액(NaHCO₃)의 타우 응집체를 1mg/mL(~ 20μM)의 농도로 재현탁합니다.<브롬/> 메모: 타우 응집체의 농도는 0.31 ^{mLmg-1 cm-1}의 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서 타우 단량체의 흡수에 의해 평가된 초기 단량체 농도를 기반으로 합니다.
2. 과열을 방지하기 위해 얼음 위에 보관하면서 프로브 초음파 처리기를 사용하여 재현탁 응집체를 초음파 처리합니다.
   1. 65 %의 진폭을 사용하십시오 (250W의 초음파 발생기 사용).
   2. 과열을 방지하기 위해 펄스 사이에 8초의 일시 중지와 함께 3초의 15회 펄스를 수행합니다.
3. 제조업체의 지시에 따라 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 pH에 민감한 염료(이하 pH 염료라고 함)의 8.9mM 원액을 준비합니다.
   메모: 항상 새 용액을 준비하고 준비된 날에만 사용하십시오.
4. 단백질 몰당 10몰의 염료를 0.2mM의 최종 염료 농도에 추가합니다.
5. 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다.
6. 반응 혼합물을 빛으로부터 보호된 실온에서 45-60분 동안 배양합니다.
7. 그 동안, 제조업체의 지침에 따라 가교 결합된 dextran gel 탈염 컬럼을 조립하십시오.
8. 3% DMSO를 포함하는 25mL의 0.1M NaHCO₃ 완충액 pH 8.5로 컬럼을 평형화합니다. 플로우 스루를 버립니다.
9. 타우 응집체 라벨링 반응의 생성물을 총 부피 2.5mL의 컬럼에 추가합니다. 샘플이 2.5mL 미만인 경우 총 부피가 2.5mL가 될 때까지 버퍼를 추가합니다.
10. 샘플이 포장 된 젤에 완전히 들어가도록하고 플로우 스루를 버리십시오.
11. 3.5mL의 0.1M NaHCO₃ 완충액, pH 8.5, 3% DMSO로 용리하고 2mL 튜브에서 4개의 등가 분획으로 용리액을 수집합니다.
12. bicinchoninic acid (BCA) assay로 4개 분획의 단백질 농도를 측정합니다.
13. 라벨이 부착된 단백질을 -20°C 냉동고에 보관하십시오.

3. FACS(Fluorescence-activated Cell Sorting) 판독을 통한 흡수 분석

1. 1일차 – 세포 씨 뿌리기
   1. 배양 배지를 제거하고 1x 인산염 완충 식염수(PBS)를 첨가하여 플라스크에서 BV-2 세포를 세척합니다.
      메모: 세척량은 사용된 세포 플라스크의 크기에 따라 다릅니다. 예를 들어, T175 플라스크의 경우 10mL의 1x PBS로 세척합니다.
   2. 플라스크에서 PBS를 제거하고 세포가 플라스크에서 분리될 때까지 37°C에서 0.05% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 5% CO₂로 배양하여 세포를 분리합니다(약 5분).
      메모: 트립신-EDTA 0.05%의 부피는 사용된 세포 플라스크의 크기에 따라 다릅니다. 예를 들어, T175 플라스크의 경우 트립신-EDTA 0.05% 2mL를 사용합니다.
   3. 배양 배지에서 3-5회 위아래로 피펫팅하여 세포를 재현탁합니다.
      참고: 배양 배지의 부피는 사용된 세포 플라스크의 크기와 플라스크에 있는 총 세포 수에 따라 달라집니다. 예를 들어, T175 플라스크의 경우 8mL의 배양 배지를 사용합니다.
   4. 세포를 계수하고 200 μg/mL 헤파린을 함유한 배양 배지에서 1 x 10⁵ cells/mL의 최종 농도로 세포 현탁액을 생성합니다.
   5. 플레이트: 96웰 조직 배양 평면 바닥 플레이트에서 웰당 250μL의 세포 현탁액(2.5 x 10,⁴개 세포).
   6. 37 ° C 및 5 % CO₂에서 밤새 플레이트를 배양합니다.
2. 1일차 – 면역복합체 준비
   1. 얼음 위에서 pH 염료 타우를 해동합니다.
   2. 무혈청 배지(SFM)에서 pH 염료-타우 응집체의 500nM 용액 조건당 65μl를 준비합니다(100U/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신 및 200μg/mL의 헤파린이 보충된 고포도당 DMEM).
   3. 65μl의 SFM에서 최종의 두 배 농도로 항체 희석액을 준비합니다. pH 염료-타우 응집체와 항체를 96웰 u-바닥 플레이트에 혼합합니다. 조건별 최종 부피는 이제 130 μl이고 pH 염료-타우 응집체 농도는 250 nM입니다. 희석 플레이트를 밀봉하고 37 °C에서 밤새 배양합니다.
3. 2일차 – 면역복합체 흡수
   1. BV-2 세포에서 배양 배지를 제거합니다. 100μL 실온 1x PBS로 셀을 한 번 세척합니다.
   2. 멀티채널 피펫을 사용하여 125 μL의 면역복합체를 세포로 전달합니다. 37°C 및 5% CO₂에서 2시간 동안 면역복합체가 있는 세포를 배양합니다.
   3. 세포에서 배양 배지를 제거하고 폐기합니다. 100μL 실온 1x PBS로 셀을 한 번 세척합니다.
   4. 1x PBS를 제거하고 37°C 및 5% CO₂에서 20분 동안 50μL 트립신-EDTA 0.25%로 세포를 처리합니다.
   5. 200 μL의 배양 배지를 추가하고 위아래로 피펫팅하여 세포를 분리하여 잘 재현탁합니다. 세포를 96웰 U-바닥 플레이트로 이동합니다. 400 x g의 원심분리기 플레이트, 4°C에서 5분 동안 보관.
   6. 플레이트를 얼음 위에 놓고 배양 배지를 제거한 다음 세포 펠릿을 150μL의 얼음처럼 차가운 1x PBS에 재현탁하여 세포를 두 번 세척합니다. 400 x g의 원심분리기 플레이트, 4°C에서 5분 동안 보관.
   7. 세포를 얼음 위에 올려 놓고 첨가된 1x PBS를 제거한 후 150μL 저온 FACS 완충액(1x PBS, 0.5% 소 혈청 알부민(BSA), 2mM EDTA)에 세포 펠릿을 재현탁하여 세척합니다. 400 x g의 원심분리기 플레이트, 4°C에서 5분 동안 보관.
   8. 세포를 얼음 위에 놓고 추가된 FACS 완충액을 제거한 다음 200μL 차가운 FACS 완충액에 세포를 재현탁합니다.
   9. FACS가 라이브 셀 게이트에서 2 x 10⁴ 이벤트를 획득하여 즉시 샘플을 분석합니다(4.1단계 참조).