중국 햄스터 난소 세포에서 생산된 단일클론 항체를 정제하는 기술

초록

출처: Velugula-Yellela, S. R., et al. Automated Microbioreactor System을 사용한 중국 햄스터 난소 세포의 단클론 항체 정제 및 분석. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 중국 햄스터 난소 세포에서 수확한 세포 배양액에서 단클론 항체를 정제하는 분석을 보여줍니다. 이 제품은 고정화된 단백질 A가 있는 다공성 유리 수지를 사용하며, 이 수지는 샘플에 있는 항체의 Fc 영역에 결합하여 오염 물질로부터 효과적으로 분리합니다. 낮은 pH의 용출 완충액을 사용하면 상호 작용이 약화되어 정제된 항체의 회수가 용이해집니다.

프로토콜

1. 항체 정제

참고: 원내 항체의 평형 버퍼는 25mM Tris, 100mM NaCl, pH 7.5입니다. 사용된 용리 완충액은 0.1M 아세트산입니다. 완충액과 수지(단백질 A)는 정제된 특정 항체에 따라 달라집니다. 컬럼 부피는 수지의 베드 높이와 동일합니다. 사용되는 이동상의 양은 컬럼 부피 측면에서 결정됩니다.

1. 정화 시스템 초기화
   1. 정제 시스템에 연결된 소프트웨어를 엽니다. 수동 지침을 사용하여 40분 동안 2mL/분의 유속으로 평형 버퍼가 있는 컬럼을 평형화합니다. 평형 후 수동 실행을 중지합니다.
   2. 분획 분취기(fraction collector)에 15mL 코니컬 튜브를 배치하여 정제된 항체 용리액을 수집하고 50mL 코니컬 튜브를 배치하여 고염 세척 중에 플로우스루(flow-through)를 수집합니다. 실행을 시작하기 전에 분획 분취기를 열고 닫아 분획 분취기가 시작 위치로 재설정되었는지 확인합니다. 분획 분취기는 7°C.
      로 유지됩니다. 메모: fraction collector는 15 mL 및 50 mL tube 모두에 대해 설정의 Fraction Collector 탭에서 수동으로 재설정할 수 있습니다.
2. 샘플 주입
   메모: 다음 절차에 사용된 수확된 세포 배양액은 자동화된 마이크로 생물반응기에서 배양된 중국 햄스터 난소 세포에서 얻은 것입니다.
   1. 0.22μm의 여과된 수확 세포 배양액을 노즐 끝이 막혀 있는 빈 12mL 주사기에 추가합니다.
   2. 노즐이 아래를 향하도록 주사기를 잡고 플런저의 작은 부분이 들어갈 때까지 주사기 플런저를 삽입합니다. 유체가 누출되지 않는지 확인하고 노즐이 위를 향하도록 주사기를 돌리고 캡을 제거합니다.
   3. 노즐이 위를 향하도록 주사기를 잡고 세포 배양 유체가 노즐 끝에 올 때까지 실린더를 밀어 공기를 제거합니다. 주사기 노즐을 정제 시스템의 수동 주입 포트에 삽입하고 비틀어서 조입니다.
   4. 모든 샘플이 주입되고 부착된 10mL 대용량 샘플 루프에서 볼 수 있을 때까지 플런저를 아래로 누릅니다.
   5. 저장된 방법 파일을 엽니다. 결과 파일을 필요한 위치에 저장하고 메시지가 표시되면 파일 이름을 지정합니다. 샘플이 대용량 샘플 루프에 주입된 후 실행을 누르십시오.
3. purification method 실행
   1. 저장된 Method를 선택하고 기기 소프트웨어에서 메시지가 표시되면 run을 클릭합니다(단계 1.2.5).
      메모: 시스템은 다음 단계를 실행하도록 설정되어 있습니다. 기기가 작동하는 동안 사용자는 아무 것도 할 필요가 없습니다.
   2. 3개의 컬럼 부피(CV)의 평형 완충액으로 2mL/분의 유속으로 컬럼을 평형화합니다. 컬럼이 평형을 이루면 시스템은 대용량 샘플 루프를 사용하여 1mL/분의 유속으로 샘플을 컬럼에 주입합니다.
   3. 280nm에서 UV 신호가 떨어지면 샘플 로딩이 완료되었음을 나타냅니다. UV 신호가 25mAU 미만으로 떨어질 때까지 2mL/분의 유속으로 평형 버퍼로 컬럼을 세척합니다.
   4. pH 7.5에서 1M NaCl의 25mM Tris의 CV 4개를 사용하여 2mL/분의 유속으로 2차 고염 세척을 수행합니다. 시스템 분획 분취기는 50mL 튜브에서 염분 세척 중에 컬럼에서 나오는 모든 단백질/DNA를 수집합니다.
   5. 1mL/분의 유속으로 5개의 CV를 용출 버퍼를 적용하여 컬럼에서 항체를 용리시킵니다. UV 신호를 기반으로 15mL 튜브에 용리액을 수집합니다. UV 280 신호가 35mAU 이상이면 수집이 시작됩니다. 신호가 50mAU 미만으로 떨어지면 수집이 종료됩니다. 이를 피크 절삭이라고 합니다.
      메모: 피크 절단은 용리 프로파일의 정규화를 보장하고 단백질 응집체를 포함할 수 있는 용리 피크 테일링을 방지합니다.
   6. 3개의 CV of equilibration buffer를 사용하여 컬럼을 세척합니다. 세척 단계 후에 실행이 끝납니다.
   7. 용출 후 즉시 1M Tris 염기를 사용하여 정제 된 단백질을 ~ 5.5의 pH로 중화하십시오. 280nm 및 260nm에서 마이크로볼륨 UV-Vis 분광 광도계를 사용하여 단백질 농도를 측정하고 4°C에서 보관합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CHO DG44 세포주	인비트로젠	A1100001
악타 아반트 25	제너럴 일렉트릭 생명과학	28930842
Pro Sep vA 울트라 크로마토그래피 수지	밀리포어 시그마	115115830	정제 고정상(Purification Stationary Phase)
옴니핏 10cm 컬럼	Diba 플루이드 인텔리전스	006EZ-06-10-AA	고정상용 하우징
트리스 베이스	피셔 사이언티픽	BP154-1
수퍼루프 10 mL	GE 헬스케어	Tel.: 18-1113-81
μDawn 다중 각도 광 산란 검출기	와이어트	우던-01
0.22μm Millex GV 필터 유닛 PVDF 멤브레인	머크 밀리포어	SLGV033RB
10X 인산염 완충 식염수	코 닝	46-013-CM
12mL 주사기	코비디엔	8881512878
50 mL 팔콘 튜브	코닝 Inc.	352070
96웰 플레이트	바이오 라드	127737
아세트산	시그마-알드리치	695072
Amicon Ultra-4 100kDa 원심 필터	머크 밀리포어	UFC810096
아미노산 표준물질, 1 nmol/μL	애질런트 테크놀로지스	5061-3330
아미노산 보충제	애질런트 테크놀로지스	5062-2478
포름산암모늄 용액 - 글라이칸 분석	워터스 코퍼레이션	186007081
블루 스크류 캡(셉타가 있는 경우	애질런트 테크놀로지스	5182-0717
크로마토그래피 용수(MS 등급)	피셔 케미컬	승6-4
염산	피셔 사이언티픽	A144-500
Intact mAb 질량 검사 표준물질	워터스 코퍼레이션	186006552
Intrada 아미노산 컬럼 150 x 2mm	임탁트	와아25
NanoDrop One 미량 UV-Vis 분광광도계	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	840274100

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