해마 신경 배양을 이용한 인간 혈청에서 자가항체를 검출하기 위한 분석

초록

출처: Cunquero, M., et al. 자가면역 뇌염에 관여하는 새로운 병원성 항체를 검출하고 연구하기 위한 해마 신경 배양. J. Vis. 특급. (2022년)

이 비디오는 쥐 해마 신경 세포 배양을 사용하여 샘플에서 특정 항원에 대한 항체를 식별하는 기술을 보여줍니다. N-Methyl-D-aspartate receptor(NMDAR)를 표적으로 하는 자가항체가 포함된 환자 샘플에 배양된 뉴런을 노출시킴으로써, 면역염색을 통해 뉴런 표면에 결합된 자가항체의 존재를 밝힙니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

PART 1: 해리, 태아, 설치류 해마 신경 배양 확립

1. 준비 단계

1. 도금 표면의 Poly-L-Lysine(PLL) 코팅(해부 3일 전)
   1. 증류수 500mL에 붕산 2.38g과 붕사 1.27g을 넣고 녹을 때까지 15분 동안 교반하여 붕산염 완충액을 준비합니다. 후드 아래에서 여과(0.2μm 공극 크기)로 완충 용액을 살균하고 라벨을 부착한 다음 실온(RT)에서 보관합니다.
      메모: 이 솔루션은 안정적이며 6개월 동안 사용할 수 있습니다.
      주의: 붕산염 완충액을 준비할 때 권장되는 개인 보호 장비를 착용하십시오.
   2. 증류수 10mL에 PLL 1g을 넣고 용해될 때까지 저어주어 PLL 스톡 용액(100mg/mL)을 준비합니다. 500μL의 PLL 원액을 준비합니다. 최종 농도인 1mg/mL에 도달하려면 500μL의 PLL 분취액을 50mL의 붕산염 완충액에 추가하고 용해될 때까지 소용돌이친 다음 여과(0.2μm 공....

결과

그림 1: 해마 뉴런의 1차 배양을 위한 시각적 프로토콜. (A) E18에서 배아 쥐로부터 해마 뉴런의 해리 세포 배양을 준비하기 위한 프로토콜의 세 부분을 보여주는 순서도. 프로토콜은 1로 나뉩니다. 해마 격리, 2. 세포 해리, 그리고 3. 세포 파종. (B) 배아 채취를 위한 (1- 집게, 2- 곡선 집게, 3- 가위), 뇌 추출을 위한 (4- 가는 곡선 집게, 5- 가는 직선 집게, 6- 수술 가위), (7- 미세 각도 집게, 8- 정밀 스프링 가위) 해마 격리를 위한 세 가지 범주로 그룹화된 해마 격리를 위한 권장 도구 선택. (C) 해마 분리에 필요한 플레이트와 매체가 있는 얼음 트레이 1의 개략도. 배아와 머리는 HB.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10cm 세포 배양 접시	눕크	제12-565-020
12mm 원형 커버 슬립	어부	NC9708845
20x NA 0.75 S 플루어 공기 대물렌즈	니콘	CFI 슈퍼 플루어 20X
3.5cm 세포 배양 접시	눕크	Tel.: 12-565-90
6cm 세포 배양 접시	눕크	Tel.: 12-565-94
B27 보충제	지브코	제17504-044
비커 100 mL	피렉스	-
붕 사	시그마-알드리치	B9876
붕산	시그마-알드리치	나0252
곡선형 집게	증권 시세	11009-13
D-포도당	시그마-알드리치	D9434
DMEM 고포도당(4.5g/L), L-글루타민 없음, 페놀 레드 없음	염소자리	DMEM-HXRXA
암컷 Wistar 쥐 (임신 18일)	잔비에	-
소 태아 세럼(FBS)	바이오웨스트	S181B-500
미세한 각도의 집게	증권 시세	11251-35
세밀한 곡선의 집게	증권 시세	11272-30
가는 직선 집게	증권 시세	11251-23
FITC 필터 큐브	니콘	표준 시리즈
집게	증권 시세	11000-12
염소 안티 휴먼 AF488	인비트로젠	A11013
HBSS (하이브에스)	염소자리	HBSS-1A
헤페스	시그마-알드리치	H3375 (영문
Hibernate-E 매체	지브코	A12476-01
호스 세럼 (HS)	써모피셔	26050088
인간 항-NMDAR 항체(CSF)	환자 샘플	-
인간 anti-NMDAR 항체 (혈청)	환자 샘플	-
이미지J/피지	국립보건원(NIH)	v1.50i
도립 형광 현미경	니콘	이클립스 TE2000-U
인산염 완충 식염수	지브코	10010023
폴리-L-라이신(PLL)	펩타이드 국제	OKK-35056
폴리스티렌 얼음 트레이	-	-
정밀 스프링 가위	증권 시세	15000-08
PROLONG Gold, DAPI(변색 방지 마운팅 미디어)	분자 프로브	P36941
가위	증권 시세	14068-12
나트륨 피루브산	바이오웨스트	L0642-100
실체 현미경	자이스	스테미 2000
수술 가위	증권 시세	14081-09
트립신 2.5%	지브코	15090046
물, 멸균 내독소 무함유	시그마-알드리치	W3500

호 호 표시기 년 표시기 년 표시기 년 표시기 년 표시기 년 시리즈 ) 표시기 년 포함 (영문) 표시기 년 표시기 년 시리즈