해마 신경 배양을 이용한 인간 혈청에서 자가항체를 검출하기 위한 분석

초록

출처: Cunquero, M., et al. 자가면역 뇌염에 관여하는 새로운 병원성 항체를 검출하고 연구하기 위한 해마 신경 배양. J. Vis. 특급. (2022년)

이 비디오는 쥐 해마 신경 세포 배양을 사용하여 샘플에서 특정 항원에 대한 항체를 식별하는 기술을 보여줍니다. N-Methyl-D-aspartate receptor(NMDAR)를 표적으로 하는 자가항체가 포함된 환자 샘플에 배양된 뉴런을 노출시킴으로써, 면역염색을 통해 뉴런 표면에 결합된 자가항체의 존재를 밝힙니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

PART 1: 해리, 태아, 설치류 해마 신경 배양 확립

1. 준비 단계

1. 도금 표면의 Poly-L-Lysine(PLL) 코팅(해부 3일 전)
   1. 증류수 500mL에 붕산 2.38g과 붕사 1.27g을 넣고 녹을 때까지 15분 동안 교반하여 붕산염 완충액을 준비합니다. 후드 아래에서 여과(0.2μm 공극 크기)로 완충 용액을 살균하고 라벨을 부착한 다음 실온(RT)에서 보관합니다.
      메모: 이 솔루션은 안정적이며 6개월 동안 사용할 수 있습니다.
      주의: 붕산염 완충액을 준비할 때 권장되는 개인 보호 장비를 착용하십시오.
   2. 증류수 10mL에 PLL 1g을 넣고 용해될 때까지 저어주어 PLL 스톡 용액(100mg/mL)을 준비합니다. 500μL의 PLL 원액을 준비합니다. 최종 농도인 1mg/mL에 도달하려면 500μL의 PLL 분취액을 50mL의 붕산염 완충액에 추가하고 용해될 때까지 소용돌이친 다음 여과(0.2μm 공극 크기)를 여과하여 용액을 멸균합니다(0.2μm 공극 크기).
      메모: 이 솔루션은 안정적이며 6개월 동안 사용할 수 있습니다.
   3. 코팅을 위해 표면을 준비합니다. 면역 염색 절차에는 직경 12mm의 커버슬립을 사용하고 살아있는 뉴런 이미징을 포함하는 연구를 위해 유리 바닥 접시를 사용합니다. 커버 슬립을 사용하는 경우 오토클레이브한 다음 각 접시(직경 3.5cm)에 5개의 커버슬립을 놓습니다.
      메모: 커버슬립의 두께는 획득된 이미지의 신호 품질과 강도에 영향을 미칩니다. 대부분의 microscope objective는 #1.5 coverslips를 위해 설계되었습니다. 이미징 설정 및 기술에 따라 적절한 커버슬립을 선택하십시오.
   4. 후드 아래에서 각 접시(유리 바닥 접시 또는 5개의 커버슬립이 있는 3.5cm 접시)에 1.5mL의 PLL 용액을 추가합니다. 모든 커버슬립이 물에 잠겨 24시간 동안 RT에 보관되었는지 확인하십시오.
   5. 해부 2일 전에 PLL 용액을 흡인하고 멸균 내독소가 없는 물로 세척하여 커버슬립이 물에 잠겼는지 확인합니다. 접시에 물을 보관하고 24시간 동안 RT에서 보관하십시오.
   6. 해부 1 일 전에 물을 흡입하고 NB + B27 배양 배지 (아래 참조)로 교체하고 접시를 37 ° C의 인큐베이터에 24 시간 동안 놓습니다.
2. 배양 배지 및 원액 준비(해부 1일 전)
   1. Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM): L-글루타민 및 페놀 레드가 없는 DMEM 고혈당(4.5g/L) 500mL에 말 혈청 50mL, 소 태아 혈청(FBS) 50mL, L-글루타민(200mM) 10mL, 피루브산 나트륨(100mM) 10mL, 페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL) 10mL를 추가합니다. 여과(0.2μm 공극 크기)를 밀봉한 캡을 4°C의 5mL 분취량에 보관합니다.
      메모: 이 솔루션은 안정적이며 1개월 동안 사용할 수 있습니다.
   2. B27(NB + B27)이 보충된 Neurobasal(NB) 배지: 페놀이 빨간색이 없는 NB 배지 50mL에 B27 보충제 1mL를 추가합니다.
   3. B27이 보충된 Hibernate-E 배지(Hibernate + B27): Hibernate-E 배지 50mL에 B27 보충제 1mL를 추가합니다.
   4. 세포 외 생리학적 용액(EPS): 멸균수 1L에 지정된 최종 농도에서 NaCl(140mM), KCl(3.5mM), N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄술폰산)(HEPES, 10mM), 포도당(20mM) 및 CaCl₂(2mM)를 추가합니다. 용해될 때까지 저어주고 NaOH(0.5M) 또는 HCl(0.5M)을 첨가하여 pH를 7.4로 조정합니다. 후드 아래에서 여과(0.2μm 기공 크기)로 살균하고 4°C에서 보관합니다.
3. 장비 및 기타 실험실 재료(해부 당일)
   1. 수조를 37°C로 설정합니다. 행크스 평형 염 용액(HBSS) 50mL와 DMEM 5mL를 분취액으로 가열합니다.
   2. 앱솔루트 에탄올이 들어있는 비커에 담그면 다음 도구를 살균합니다(그림 1B): 집게, 곡선 집게, 가위, 가는 곡선 집게, 가는 직선 집게, 수술 가위, 미세 각도 집게 및 정밀 스프링 가위.
      메모: 도구를 보호하려면 비커 바닥에 부드러운 재료(예: 과학 정밀 물티슈)를 놓으십시오.
   3. 두 개의 쟁반에 얼음을 채우고 다음 항목을 놓습니다.
      1. 얼음 트레이 1 (그림 1C): 앱솔루트 에탄올이 든 비커에 수술 도구를 넣고, 수술 도구를 헹구기 위한 HBSS가 있는 비커, 배아를 놓기 위한 HBSS가 있는 10cm 접시, 배아의 머리를 놓기 위한 HBSS가 있는 6cm 접시, 배아의 뇌를 놓기 위해 Hibernate + B27이 있는 6cm 접시
      .
      2. 얼음 트레이 2: 트립신 2.5% 분취액 1mL와 해마를 위한 Hibernate + B27이 든 3.5cm 접시를 놓습니다.
         메모: 이 절차에 필요한 시간은 연구자의 경험과 해부할 배아의 수에 따라 다릅니다. 따라서 얼음은 필요한 시간 동안 얼어 있어야 합니다. 이를 위해 폴리스티렌 트레이를 사용하는 것이 좋습니다.

2. 해부 및 시딩(그림 1)

1. 해마 격리
   메모: 배아 18일(E18)에 배아를 임신한 쥐는 실험 동물의 사용 및 관리에 관한 유럽(2010/63/UE) 규정에 따라 바르셀로나 대학의 지역 윤리 위원회에 따라 프로토콜이 시작되기 직전에 안락사됩니다. 이 프로토콜에서는 이산화탄소(CO₂) 흡입이 안락사 방법으로 사용되었습니다.
   1. 집게와 가위를 사용하여 복부 복막 수준에서 쥐를 해부합니다. E18 배아로 자궁을 적출하고 얼음에 식힌 10cm 접시에 담습니다.
      참고: 배아에 쥐털이 붙지 않도록 하는 것이 중요합니다. 복부를 살균하기 위해 70% 에탄올을 다량 사용하는 것이 좋습니다. 이 단계부터 얼음 트레이 1의 후드 내부에서 작업합니다.
   2. 배아 주머니를 열고 HBSS가 있는 10cm 접시에 배아를 옮겨 배아가 완전히 잠겼는지 확인합니다.
   3. 가위로 배아 머리를 제거하고 HBSS가 있는 6cm 접시에 넣습니다. 모든 embryos.
      에 대해 이 과정을 반복합니다. 메모: 오염을 방지하기 위해 배아 머리를 제외한 모든 조직은 나사 뚜껑이 있는 용기에 버려야 합니다.
   4. 가는 곡선의 집게로 배아 머리를 잡고 한 쌍의 가는 직선 집게로 궤도를 뚫고 45° 각도로 들어간 다음 가는 곡선의 집게를 놓습니다.
      메모: 겸자는 뇌를 통과해서는 안 되므로 들어갈 때 각도를 유지하는 것이 중요합니다.
   5. 수술 가위로 후두골부터 전두골까지 피부와 두개골을 절개합니다. 한 쌍의 미세한 곡선 집게로 뇌를 제거하고 Hibernate + B6과 함께 27cm 접시에 넣습니다. 모든 뇌가 회복될 때까지 이 과정을 반복합니다.
   6. 가늘고 곧은 집게로 telencephalons를 시상으로 분리합니다.
      메모: 이 단계부터는 해마의 해부 해부가 실체 현미경 아래에서 수행됩니다. 굴절식 램프를 사용하여 조명이 측면에서 해부 표면을 비출 수 있도록 하는 것이 좋습니다. 또한 검은색 배경을 사용하는 것이 좋으며, 이렇게 하면 더 많은 대비를 제공하여 해마를 더 잘 구별할 수 있습니다.
   7. Hibernate + B10 방울 + B27을 1cm 거리(예: 원형)에 떨어뜨려 접시를 준비합니다. Hibernate + B27 한 방울당 하나의 텔렌스팔론을 놓고 해부 범위를 통해 시각화합니다(1.25배 대물렌즈 확대 권장).
   8. 수막을 조심스럽게 벗기고 시상을 제거하여 해마를 더 잘 시각화합니다.
   9. 정밀 스프링 가위로 해마를 해부하고 얼음 트레이 3.5에 Hibernate + B27과 함께 2cm 접시에 담습니다. 모든 해마가 수집될 때까지 모든 텔렌스팔론에 대해 반복합니다.
   10. 파스퇴르 피펫으로 모든 해마를 조심스럽게 모아 50mL 튜브로 옮깁니다.
       메모: 트립신이 희석되지 않도록 해마를 채취할 때 Hibernate + B27의 최소 부피를 취하십시오.
2. 세포 해리
   1. 해마의 효소 해리
      1. 해마가 들어있는 50mL 튜브에 2.5% 트립신 1mL를 넣고 HBSS와 함께 5mL 용량으로 만듭니다. 37 °C의 수조에서 15분 동안 배양합니다.
      2. 트립신을 희석하려면 예열된 HBSS 10mL를 넣고 37°C의 수조에서 5분 동안 배양합니다.
      3. 현재 점액 덩어리로 나타나는 해마를 1,000μL 마이크로피펫이 있는 50mL 튜브로 옮기고, 예열된 HBSS 6mL를 첨가한 후 37°C의 수조에서 5분 동안 배양합니다.
   2. 해마의 기계적 해리
      1. 바닥이 원뿔형 인 2mL 튜브로 질량을 옮기고 최소 부피를 취합니다. 예열된 DMEM 여과지 1mL를 추가합니다. 1,000 μL 마이크로피펫으로 위아래로 부드럽게 흡입하여 펠릿을 균질화합니다.
         메모: 거품이 세포를 용해시킬 수 있으므로 흡입할 때 거품을 생성하지 않는 것이 중요합니다.
      2. 팁이 튜브의 원뿔형 바닥과 접촉하도록 미리 당겨진 유리 피펫(10x-20x)으로 위아래 흡인을 반복합니다. 거품을 생성하지 마십시오. 이 단계가 끝나면 혼합물은 반투명해야 합니다.
      3. 혼합물이 반투명이 되도록 균질하게 혼합된 후, 37°C에서 4mL의 DMEM 배지가 들어 있는 튜브에 혼합물을 옮기고 위아래로 피펫팅하여 유리 피펫으로 균질화합니다.
3. 세포 파종(Cell seeding)
   1. 세포를 세십시오. 용액의 뉴런 수는 표준 실험실 절차에 따라 계산할 수 있습니다.
      메모: 항체 검출 및 칼슘 활성을 위한 이미징 실험에서는 3.5cm 접시당 50,000개의 세포 농도가 최적입니다.
   2. 세포를 부유 상태로 유지하고 계산된 부피를 빼내고 PLL 코팅된 커버슬립이 포함된 3.5cm 접시 또는 PLL 코팅된 유리 바닥 접시에 플레이트합니다.
   3. 교차된 움직임(앞뒤로, 좌우로, 필요에 따라 반복)으로 부드럽게 흔들어 접시에 세포를 고르게 분포시키고 접시를 CO₂(5%) 인큐베이터에 넣습니다.
      메모: 세포가 접시 주변에 정착하는 것을 피하기 위해 교차 움직임을 사용하는 것이 중요합니다.
   4. 매주 약 1mL의 NB + B27을 첨가하여 배양이 건조되지 않도록 합니다.
      메모: 2주(시험관 내 14일[div]) 후 뉴런은 성숙해지고 실험에 사용할 모든 요인을 발현합니다. 이 프로토콜을 사용하여 얻은 총 평균 뉴런 수는 임신한 쥐 당 평균 12개의 E18 배아에서 나오는 약 2.5 x 10⁶개의 뉴런입니다.

PART 2: 신경 세포 표면 단백질에서 항체 검출을 위한 해마 신경 배양 사용

참고: 프로토콜의 이 부분은 항NMDAR 뇌염 환자의 혈청 및/또는 CSF에서 항-NMDAR 항체를 확인하기 위해 해마 배양을 사용하는 방법을 보여줍니다. 형광 면역 염색은 살아있는 뉴런의 반응성을 시각화하는 데 사용되지만 다른 시각화 방법도 사용할 수 있습니다. 이 실험에 적합한 대조군은 건강한 개인의 혈청 또는 CSF입니다. 인체 표본을 사용할 때는 기관 윤리 위원회의 승인이 필요할 수 있음을 명심하십시오.

3. 생형광 면역염색

1. 커버슬립에서 성장한 14개의 div 세포를 사용합니다(50,000개의 커버슬립이 포함된 3.5cm 접시당 세포).
2. 후드 내부에서 37°C로 예열된 NB로 커버슬립을 헹굽니다.
3. 이 경우 혈청의 경우 1:200, CSF의 경우 1:2로 NB 배지에 희석된 항-NMDAR 항체(1차 항체로 사용됨)가 포함된 샘플을 추가하고 37°C(CO₂(5%) 인큐베이터 내부)에서 1시간 동안 배양합니다.
4. 상온에서 인산염 완충 식염수(PBS)로 3회 조심스럽게 헹굽니다.
5. 정착 용액(PBS의 4% 포름알데히드)을 추가하고 RT에서 5분 동안 배양합니다.
   주의: 4% 포름알데히드를 취급할 때는 후드 내부에서 작업하고 권장되는 개인 보호 장비를 착용하십시오.
6. PBS로 각각 5분 동안 3번 세탁합니다.
7. 1:1000 희석에서 2차 항체 Goat anti-Human AF488을 추가하고 RT에서 1시간 동안 배양
   메모: 배양 중에는 알루미늄 호일로 덮어 빛에 노출되지 않도록 보호하십시오.
8. PBS로 각각 5분 동안 3번 세탁합니다. 증류수로 헹굽니다
9. 액체 장착 매체(예: DAPI를 사용한 퇴색 방지 장착 매체, 약 7μL)로 커버슬립을 장착하고 남아 있는 액체를 흡입한 다음 증류수로 헹굽니다. 이제 뉴런은 형광 이미징을 할 준비가 되었습니다.
   주의: 장착 매체를 다룰 때는 권장되는 개인 보호 장비를 착용하십시오.

결과

그림 1: 해마 뉴런의 1차 배양을 위한 시각적 프로토콜. (A) E18에서 배아 쥐로부터 해마 뉴런의 해리 세포 배양을 준비하기 위한 프로토콜의 세 부분을 보여주는 순서도. 프로토콜은 1로 나뉩니다. 해마 격리, 2. 세포 해리, 그리고 3. 세포 파종. (B) 배아 채취를 위한 (1- 집게, 2- 곡선 집게, 3- 가위), 뇌 추출을 위한 (4- 가는 곡선 집게, 5- 가는 직선 집게, 6- 수술 가위), (7- 미세 각도 집게, 8- 정밀 스프링 가위) 해마 격리를 위한 세 가지 범주로 그룹화된 해마 격리를 위한 권장 도구 선택. (C) 해마 분리에 필요한 플레이트와 매체가 있는 얼음 트레이 1의 개략도. 배아와 머리는 HB...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10cm 세포 배양 접시	눕크	제12-565-020
12mm 원형 커버 슬립	어부	NC9708845
20x NA 0.75 S 플루어 공기 대물렌즈	니콘	CFI 슈퍼 플루어 20X
3.5cm 세포 배양 접시	눕크	Tel.: 12-565-90
6cm 세포 배양 접시	눕크	Tel.: 12-565-94
B27 보충제	지브코	제17504-044
비커 100 mL	피렉스	-
붕 사	시그마-알드리치	B9876
붕산	시그마-알드리치	나0252
곡선형 집게	증권 시세	11009-13
D-포도당	시그마-알드리치	D9434
DMEM 고포도당(4.5g/L), L-글루타민 없음, 페놀 레드 없음	염소자리	DMEM-HXRXA
암컷 Wistar 쥐 (임신 18일)	잔비에	-
소 태아 세럼(FBS)	바이오웨스트	S181B-500
미세한 각도의 집게	증권 시세	11251-35
세밀한 곡선의 집게	증권 시세	11272-30
가는 직선 집게	증권 시세	11251-23
FITC 필터 큐브	니콘	표준 시리즈
집게	증권 시세	11000-12
염소 안티 휴먼 AF488	인비트로젠	A11013
HBSS (하이브에스)	염소자리	HBSS-1A
헤페스	시그마-알드리치	H3375 (영문
Hibernate-E 매체	지브코	A12476-01
호스 세럼 (HS)	써모피셔	26050088
인간 항-NMDAR 항체(CSF)	환자 샘플	-
인간 anti-NMDAR 항체 (혈청)	환자 샘플	-
이미지J/피지	국립보건원(NIH)	v1.50i
도립 형광 현미경	니콘	이클립스 TE2000-U
인산염 완충 식염수	지브코	10010023
폴리-L-라이신(PLL)	펩타이드 국제	OKK-35056
폴리스티렌 얼음 트레이	-	-
정밀 스프링 가위	증권 시세	15000-08
PROLONG Gold, DAPI(변색 방지 마운팅 미디어)	분자 프로브	P36941
가위	증권 시세	14068-12
나트륨 피루브산	바이오웨스트	L0642-100
실체 현미경	자이스	스테미 2000
수술 가위	증권 시세	14081-09
트립신 2.5%	지브코	15090046
물, 멸균 내독소 무함유	시그마-알드리치	W3500

호 호 표시기 년 표시기 년 표시기 년 표시기 년 표시기 년 시리즈 ) 표시기 년 포함 (영문) 표시기 년 표시기 년 시리즈