호흡기 세포융합 바이러스에 특이적인 중화항체 역가를 측정하기 위한 분석

초록

출처: Do, L. A. H., et al., An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay.J. Vis. 특급(2019년)

이 비디오는 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에 대한 중화 항체를 측정하기 위한 분석을 보여줍니다. RSV 중화 항체가 포함된 혈청을 사용한 사전 배양은 바이러스 입자를 중화하여 세포 감염 및 플라크 형성을 줄입니다. 그런 다음 바이러스에 감염된 세포는 플라크 시각화를 위해 고정, 차단 및 형광단 접합 항체 표지를 받습니다. 이 과정을 통해 RSV의 50%를 중화하는 가장 높은 혈청 희석액을 식별할 수 있으며, 이는 중화 역가를 나타냅니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

참고: 달리 명시되지 않는 한 모든 단계는 BSL2 후드에서 수행해야 합니다. PRN 분석에 사용되는 최적의 RSV 농도를 결정하기 위해 PRN(Plaque-Reduction Neutralization) 분석 전에 바이러스 적정이 필요합니다. 바이러스 스톡을 소량으로 분주하여 한 번 해동하여 각 NAb 분석에 사용하는 것이 좋습니다. 한 연구의 모든 샘플에 대해 수행된 모든 NAb 분석에 대해 동일한 바이러스 스톡을 사용하는 것도 권장됩니다. 배양 배지와 인산염 완충 식염수(PBS)를 세포 플레이트에 추가하기 전에 37°C에서 예열되었는지 확인합니다.

1. RSV 바이러스 적정

참고: 바이러스 재고의 수와 중복의 수에 따라 그림 1에 따라 분석 플레이트를 설정할 수 있습니다. 각 바이러스 스톡은 가장 높은 바이러스 농도(즉, 1:10)에서 시작하여 분석 플레이트를 따라 3배로 적정해야 합니다. 연속 적정은 일반적으로 1:10일 수 있습니다. A549 세포 배양 및 유지 관리 및 RSV 배양 절차는 표준 절차를 사용하여 수행되며 이 프로토콜에 포함되지 않습니다.

1. 파종 플레이트(1일차)
   1. Dulbecco의 Modified Eagles 배지(DMEM) + 10% 태아 송아지 혈청(FCS) + 1000 IU 페니실린/스트렙토마이신(펜/연쇄상구균)에서 A549 세포를 4 x 10⁵/mL로 재현탁합니다. 4 x 10 4 A459 셀을 포함하는 100 μL/well의 96웰 평면 바닥 멸균 플레이트를 시드합니다.
   2. 37 ° C, 5 % 이산화탄소 (CO₂)에서 밤새 플레이트를 배양합니다 (세포는 로그 단계 성장에 있습니다).
      메모: 23회 계대 후에 새 A549 셀 바이알을 사용하십시오. 새로운 세포 바이알이 처음 세 계대에 있을 때 실험을 시작하지 않는 것이 좋습니다.
2. 바이러스 감염 (2일차)
   1. 바이러스 연속 희석의 제조
      1. 37°C의 수조에서 거의 완전히 해동될 때까지 얼어붙은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 바이알 하나를 빠르게 해동하고 즉시 얼음 위에 놓습니다. 분석할 각 RSV 바이러스 스톡에 대해 3개의 복제물을 준비하고, 100μL의 희석된 바이러스/웰로 1:10의 초기 바이러스 스톡 희석을 사용하고, 음성 대조군을 위해 하나 이상의 컬럼을 예약합니다.
         참고: 그림 1은 음의 대조군을 삼중으로 보여줍니다.
      2. 96웰 U-bottom 멸균 플레이트의 A행의 3중으로 1:10에 희석된 각 바이러스 100μL를 추가합니다. 90μL/well의 DMEM + FCS가 없는 1000IU 펜/연쇄상구균을 B열에서 H열에 추가합니다.
      3. A행에서 B행으로 10μL를 전송하여 플레이트를 따라 연속 1:10 희석을 수행합니다. 내용물을 위아래로 5회 피펫팅하여 용액을 혼합하고 H행까지 10배 희석을 계속합니다. 각 웰의 최종 부피가 90μL가 되도록 최종 10μL를 버립니다.
         참고: 각 희석액에 대해 새로운 팁을 사용하는 것이 중요합니다.
   2. A549 세포에 바이러스 접종
      1. 전날 준비된 A549 셀 플레이트를 회수합니다. 96웰 플레이트의 A549 세포 단층이 ~80% 합류하는지 확인합니다. 플레이트를 부드럽게 뒤집고 멸균 흡수성 종이 타월에 가볍게 두드려 미디어를 폐기합니다.
      2. 100μL의 PBS로 모든 웰을 두 번 세척하고, 세척할 때마다 플레이트를 부드럽게 뒤집고 멸균 흡수성 종이 타월로 가볍게 닦아서 초과 PBS를 폐기합니다. 접시가 마르지 않도록 하십시오.
      3. 바이러스 적정 플레이트(그림 1)의 바이러스 희석액을 A549 세포 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다. 37 ° C, 5 % CO₂ 에서 1 시간 동안 플레이트를 배양합니다. 1 h 배양 후, 피펫을 사용하여 상층액을 디캔팅합니다 (교차 오염을 피하기 위해). 90μL/웰을 꺼냅니다.
      4. 1x 매체 199(M199, 재료 표 참조) 100μL + 1.5% 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨염(CMC) 저점도 + 펜/연쇄상구균을 함유한 2% FCS를 각 웰에 추가합니다.
         참고: 2x M199 + 4% FCS + 2% 펜/스트렙 및 3% CMC 용액은 나중에 사용할 수 있도록 4°C에서 준비하고 보관해야 합니다. 플레이트에 추가하기 전에 용액이 37°C로 가열되었는지 확인하십시오.
         1. 2x M199 용액 준비: 1봉지/500mL 증류수 + 20mL FCS + 10mL 펜/연쇄상구균(2x MI99 구성). 0.22μm 필터 장치를 사용하여 용액을 여과합니다.
         2. 3% CMC를 준비하려면 CMC 15g을 증류수 500mL에 천천히 첨가합니다. CMC를 50°C의 금속 교반기 히터를 사용하여 물에 녹이며 준비하는 데 약 1시간이 걸립니다. 잘 섞어 3% CMC를 만들고 용액을 오토클레이브합니다.
            알림: CMC 고체는 용해될 물에 첨가되어야 합니다. 건조한 고체에 물을 추가하면 용해하기 매우 어려운 고체의 "덩어리"가 생성됩니다.
         3. 1.2.2.4.2단계에서 준비한 2x M199와 3% CMC를 1:1로 혼합하여 펜/연쇄상구균이 포함된 1x M199 + 1.5% CMC 저점도 + 2% FCS를 준비합니다.
      5. 3 ° C, 5 % CO₂에서 3 일 동안 플레이트를 배양합니다.
3. 분석 플레이트 및 분석 개발(5일차)
   1. Fixation and developing assay plate (어세이 플레이트 정착 및 개발)
      1. 플레이트를 부드럽게 뒤집어 펜/연쇄상구균이 포함된 M199 + CMC + 2% FCS를 폐기합니다. 세포를 고정하기 위해 200μL의 고정 완충액(80% 아세톤, 20% PBS, -20°C에서 보관)을 천천히 첨가합니다. -20 °C에서 20분 동안 배양합니다.
      2. 정착 버퍼를 버리고 흡수성 종이 타월에 부드럽게 닦아냅니다. 접시를 아래로 향하게 하여 10분 동안 건조시킵니다.
         메모: 이 단계부터 BSL2 후드 외부에서 분석을 수행할 수 있습니다.
      3. 0.05% 폴리소르베이트 20(PBS-폴리소르베이트, 재료표 참조)을 함유하는 여과된 PBS에 5% 우유 희석제 차단 용액을 준비합니다. 200/웰 및 110웰을 기준으로 한 플레이트의 블로킹에 필요한 부피를 계산합니다: 200μL/웰 x 110웰 = 22mL(20.9mL 여과된 PBS-폴리소르베이트에 1.1mL 농축 우유 희석제). 이 단계에서, 또한 1차 및 2차 항체에 대한 충분한 차단 솔루션을 구성합니다. 50μL/웰 및 110웰을 기준으로 플레이트 1개에 대한 각 항체 용액에 필요한 부피를 계산합니다(50μL/웰 x 110웰 = 5.5mL). 따라서 단일 플레이트 분석에 필요한 우유 희석제 차단 용액의 총 부피는 33mL입니다.
      4. 200μL/well의 차단 용액을 추가합니다. 플레이트를 실온(RT)에서 30분 동안 배양합니다. 플레이트를 부드럽게 뒤집어 용액을 버리고 흡수성 종이 타월을 닦습니다.
      5. 차단 용액에 희석된 1:500 Goat X RSV 항체(mAb – 1차 항체)를 준비합니다. mAb 용액 50μL/웰을 추가하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 여과된 PBS-폴리소르베이트로 플레이트를 3회 세척합니다.
      6. 차단 용액에 희석된 1:5,000 Alexa-Fluor 당나귀 항염소 IgG(2차 항체)를 준비합니다. 2차 항체 용액 50μL/well을 추가하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 여과된 PBS-폴리소르베이트로 플레이트를 5회 세척합니다.
      7. 그림 2와 같이 FITC(fluorescein isothiocyanate) 채널 및 계수 설정을 사용하여 자동 스팟 리더에서 플레이트를 판독합니다. 플레이트를 호일로 싸서 4°C에서 보관합니다. 사용하지 않은 96웰 배양 플레이트를 사용하여 기기를 보정하고 분석 전에 계수 설정을 입력합니다.
         메모: 필요한 경우 며칠 이내에 다시 스캔할 수 있습니다. 보정 및 개수 설정을 저장하고 분석이 보정에 사용된 것과 동일한 유형의 플레이트를 사용하는 경우 향후 스캔에 사용할 수 있습니다.
      8. 웰의 이미지에서 아티팩트 플라크(artifact plaque) 또는 파괴된 세포 단층(disrupted cell monolayer)을 확인합니다(그림 3). 세포 단층이 파괴된 웰을 제외합니다.
         메모: 인공물 명판의 크기에 따라 해당 우물에 대해 수동 계수를 수행해야 할 수도 있고 해당 우물을 데이터 분석에서 폐기해야 할 수도 있습니다. 유효한 결과의 기준에는 하나 이상의 복제 웰에서 파괴된 세포 단층 또는 아티팩트 플라크가 검출되지 않고 음성 웰(바이러스가 추가되지 않은 웰)에서 검출된 플라크 형성 단위(PFU)가 없는 것이 포함됩니다.
   2. 바이러스 농도 측정
      1. 반점을 명확하게 계수할 수 있는 마지막 두 희석액을 선택합니다. 동일한 희석액에서 복제 웰의 평균 스폿 수를 계산합니다. 아래 공식을 사용하여 스톡 샘플의 바이러스 역가(mL당 PFU)를 계산합니다.
         PFU/mL = 평균 플라크 수/(희석 계수 × 웰에 첨가된 희석된 바이러스의 부피)
         메모: 이제 각 RSV 스톡에 대해 측정된 바이러스 농도를 PRN 분석(2단계)에 사용할 수 있습니다.

2. RSV 중화 분석

1. 파종 플레이트(1일차)
   1. DMEM + 10% FCS + 1000 IU 펜/연쇄상구균에서 4 x 10⁵/mL로 A549 세포를 재현탁합니다. 4 x 10⁴ A459 세포를 포함하는 100 μL/웰의 96웰 평면 바닥 멸균 플레이트를 시딩하고 37°C, 5% CO₂(세포는 로그 단계 성장에 있음)에서 밤새 플레이트를 배양합니다(세포는 로그 단계 성장에 있음).
      메모: 23회 계대 후에 새 A549 셀 바이알을 사용하십시오. 통과 번호 3 전에 A549 셀을 사용하지 않는 것이 좋습니다.
2. 바이러스 및 혈청 준비 (2일차)
   메모: 샘플 유형에 따라 NAb 분석 전에 샘플을 전처리하는 데 필요한 단계가 있습니다. NIBSC(National Institute for Biological Standards and Controls)의 요청에 따라 현재 사용할 수 있는 RSV 국제 표준 혈청을 사용하는 것이 좋습니다.
   1. 혈청 희석제의 제조
      1. RT에서 인간 RSV 참조 항혈청(참조 혈청, REF) 및 혈청 테스트 샘플을 해동합니다.혈청 샘플과 참조 항혈청을 56°C의 수조에서 사용하기 전에 30분 동안 가열합니다. 플레이트 템플릿에 따라 희석액을 준비합니다(그림 4).
      2. REF를 1:100 희석하여 준비합니다. 분석 플레이트당 FCS 없이 DMEM + pen/strep에 희석된 REF를 최소 110μL씩 준비합니다(예: 총 부피 150μL에서 1.5μL의 REF). 110μL의 1:100 희석된 REF를 96웰 U-바닥 멸균 플레이트의 웰 A12에 추가합니다.
      3. FCS가 없는 55μL의 DMEM + pen/strep을 12열의 B12 - H12 웰에 추가합니다. A행에서 B행으로 55μL를 옮기고, 내용물을 위아래로 5회 피펫팅하여 용액을 혼합하고 H행까지 계속하여 플레이트를 따라 연속 1:2 희석을 수행합니다. 각 웰의 최종 부피가 55μL가 되도록 최종 55μL의 배지를 폐기합니다. 각 희석에 대해 새 팁을 사용합니다.
      4. 1:100 희석액의 혈청 테스트 샘플을 준비합니다. 모든 혈청 샘플은 3회씩 분석되므로 혈청 테스트 샘플당 최소 110 μL/웰 x 3 = 330 μL의 부피를 준비합니다.
      5. 각 희석된 혈청 테스트 샘플 110μL를 추가합니다(1:100; S1 = 혈청 1, S2 = 혈청 2 등) 도 4에 따른 96-웰 멸균 플레이트의 해당 웰 A1 내지 A9 및 또한 E1 내지 E9에 대응하는 웰에 배치한다.
      6. X로 표시된 모든 웰에 FCS가 없는 55μL의 DMEM + pen/strep을 추가합니다. 단계 2.2.1.3에 따라 D행(샘플 1, 2 및 3의 경우)까지 직렬 1:2 희석을 수행합니다. 각 웰의 최종 부피가 55μL가 되도록 최종 55μL의 매체를 폐기합니다. 마찬가지로, E행에서 H.
         행까지의 샘플 4, 5, 6에 대해 직렬 1:2 희석을 수행합니다 메모: 각 희석에 대해 새로운 팁을 사용하는 것이 중요합니다.
      7. FCS가 없는 55μL의 DMEM + pen/strep을 10열 및 11열의 웰에 추가합니다.
   2. 바이러스의 준비
      1. 37°C의 수조에서 얼어붙은 RSV 바이알 하나를 거의 완전히 해동될 때까지 빠르게 해동하고 즉시 얼음 위에 놓습니다.
      2. 1.3.2단계에서 측정된 RSV 분취액의 농도에 따라 FCS가 없는 DMEM + pen/strep에서 바이러스를 희석합니다. 약 200 PFU/well을 제공하는 희석액을 적용합니다. 총 부피 5.5mL(100웰용)를 준비합니다.
   3. 바이러스-혈청 혼합물의 제조
      1. 플레이트 템플릿에 따라 희석된 바이러스 55μL를 1-9열의 모든 well과 10열 및 11열의 E-H(양성 대조군)의 well에 추가합니다(그림 4).
      2. FCS가 없는 55μL DMEM + pen/strep을 10열과 11열(negative control)의 A-D행의 모든 well에 추가합니다. 37 ° C, 5 % CO₂ 에서 1 시간 동안 플레이트를 배양합니다.
   4. A549 세포에 바이러스 접종
      1. 배양 기간이 끝나기 전에 2.1.1단계에서 준비한 A549 세포 플레이트를 회수합니다. 96웰 플레이트의 A549 세포 단층이 ~80% 합류하는지 확인합니다.
      2. 플레이트를 부드럽게 뒤집고 멸균 흡수성 종이 타월에 가볍게 두드려 미디어를 폐기합니다. 100μL의 PBS로 모든 웰을 두 번 세척하고, 세척할 때마다 플레이트를 부드럽게 뒤집고 멸균 흡수성 종이 타월로 가볍게 두드려 초과 PBS를 버립니다. 접시가 마르지 않도록 하십시오.
      3. 바이러스-혈청 혼합물 100μL/well을 플레이트 주형을 따라 A549 cell plate의 해당 well로 옮깁니다. 37 ° C, 5 % CO₂ 에서 1 시간 동안 플레이트를 배양합니다.
      4. 1시간 후 피펫을 사용하여 90μL/well을 꺼내고 예열된 1x M199 + 1.5% CMC + 2% FCS + 펜/연쇄상구균 100μL를 추가합니다. 3 ° C에서 3 일 동안 플레이트를 배양, 5 % CO₂.
         메모: 플레이트에 추가하기 전에 용액이 37°C에서 가열되었는지 확인하십시오.
3. 분석 플레이트 및 분석 개발(5일차)
   1. 1.3.1.1에서 1.3.1.8까지의 단계에 따라 고정 및 분석 플레이트를 개발합니다.
   2. 50% 중화 역가 측정
      1. '무혈청' 대조군 웰(positive virus control well, 10열, E-H)의 50% 이상과 미만 상호 혈청 희석 사이의 비례 거리를 계산하여 50% 중화 역가를 측정합니다.
      2. 혈청 우물과 혈청 대조 우물이 없는 곳에서 개별 바이러스 감염으로 인해 발생하는 PFU(즉, 플라크)의 수를 계산합니다. 무혈청 대조군 웰의 평균 PFU 수를 계산하고 50% 값을 결정합니다.
      3. 혈청 농도가 없는 대조군 웰의 50% 값 바로 위와 아래의 수치로 혈청 희석액을 식별합니다. 세미 로그 그래프 또는 스프레드시트 템플릿을 사용하여 x축(선형 스케일)에 PFU 수를 플롯하고 y축(로그₁₀ 스케일)에 상호 혈청 희석을 플롯합니다. 두 점 사이에 선을 긋고 이 선에서 테스트 혈청 샘플의 50% 중화 역가를 읽습니다.

결과

그림 1: RSV 스톡의 정량화를 위한 바이러스 적정 플레이트 레이아웃.v = RSV 바이러스의 재고(v1, 바이러스 배치 1의 재고, v2, 바이러스 배치 2의 재고, v3, 바이러스 배치 3의 재고), N = 음성 대조군 웰, X = 배지 추가. 색상 코딩은 플레이트 레이아웃의 시각화를 돕기 위한 것입니다.

그림 2: Spot Reader에 사용되는 카운트 설정의 예.바이러스 플라크를 계수하는 데 일반적으로 사용되는 매개변수의 스크린샷.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
세포주
A549	증권 시세	CCL-185	제공: Keith Chappell 박사, 퀸즐랜드 대학교
바이러스 균주
RSV A2	증권 시세	VR-1540	로트 번호 60430286
시약
아세톤	머 크	1000142511
Alexa-Fluor 당나귀 안티 염소 IgG (4 °C에서 보관)	생명 기술	A11055
CMC 나트륨 소금 분말	시그마-알드리치	C5678-500G
DMEM (무혈청, 3.7 g/L NaHC, P/S) (4 °C에서 보관)	과학 서비스 – 조직 배양		MCRI 사내 공급
태아 송아지 세럼 (-20 °C에서 50ml 분취액에 보관)	인터패스	증권 시세
Goat X RSV 항체	머 크	AB1128
호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에 대한 인간 다클론 항혈청(-20 °C에서 45 μL 분취액에 보관)	BEI 리소스	NR-4022	등록 시 BEI Resources를 통해 무료 주문하세요. 이 혈청은 RSV (NR-32832)에 대한 인간 항혈청 및 면역 글로불린 패널에 속합니다.
M199 파우더	생명 기술	31100035
우유 희석액 차단액 (4 °C에서 보관)	호주 바이오서치	50-82-01
페니실린/스트렙토마이신(-20°C에서 6mL 분취액에 보관)	생명 기술	15140122
Milli-Q 디스펜서의 s.d.H2O	머 크		사내 분배
배양용 멸균 1X PBS(4°C 보관)	과학 서비스 – 조직 배양		MCRI 사내 공급
트윈 20 폴리소르베이트	시그마-알드리치	9005-64-5
일반 소모품
원뿔형 팔콘 튜브(50mL)	Invitro 기술	FAL352070
필터 유닛 0.22um(500mL)	써모 피셔	NAL5660020
멸균 Eppendorf 튜브(1.5 mL)	호주 PL	AM12400
멸균 플랫 바닥 플레이트(뚜껑 포함 96웰)	인터패스	655180
멸균 U자형 바닥 플레이트(뚜껑 포함 96웰)	인터패스	650180
5ml 혈청학 피펫	시그마-알드리치	CLS4487-200개
10 mL 혈청학적 피펫	인터패스	607180
25 mL 혈청학적 피펫	시그마-알드리치	CLS4251-200개
팁 피펫 1-200 μL 투명 맥시멈 회수 랙형 사전 멸균 10RACKS x 96TIPS PKG960	피셔 바이오텍	TF-200-L-R-S
팁 피펫 5-20 μL 투명 맥시멈 회수 랙형 사전 멸균 10RACKS x 96TIPS PKG960	피셔 바이오텍	TF-20-L-R-S
팁 피펫 100-1000 μL최대 최대 복구 랙형 사전 멸균 10RACKS x 100TIPS PKG1000	피셔 바이오텍	TF-1000-L-R-S
팁 피펫 1-10 μL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001	피셔 바이오텍	TXLF-10-L-R-S
장비 및 소프트웨어
ELISpot 리더 시스템	AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, 스트라스부르크, 독일
AID ELISpot 소프트웨어 버전 5.0	AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, 스트라스부르크, 독일
마이크로소프트 엑셀 2007

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