전기화학발광 분석을 사용한 human islet 자가항체 검출

초록

출처: Gu, Y. et al., 인간 섬 자가항체에 대한 전기화학발광 분석.J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오는 인간 혈청에서 섬 자가항체의 전기화학발광 검출을 보여줍니다. 혈청의 항체는 루테늄 접합 항원을 비오틴화 포획 항원에 연결하여 전기화학발광 측정으로 검출되는 복합체를 형성합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 버퍼 준비

1. 라벨링 완충액(인산염 완충 식염수(PBS) 2개, pH 7.9): 증류된 탈이온수(DD) 물 400mL에 10x PBS 100mL를 첨가하고 수산화나트륨(NaOH)으로 pH를 7.9로 조정합니다.
2. 3mM의 비오틴: 1mg의 비오틴을 588μL의 라벨링 완충액에 용해시킵니다.
3. 3 mM의 Sulfo-tag: 150 nmol의 Sulfo-tag를 50 μL의 라벨링 버퍼에 용해시킵니다.
4. 항원 완충액(5% BSA): 1x PBS 500mL에 소 혈청 알부민(BSA) 25g을 첨가합니다.
5. 0.5M 아세트산 용액을 준비합니다.
6. 1.0M의 Tris-HCl 완충액 pH 9.0: 1M Tris-HCl 완충액을 준비하고 HCl로 pH를 9.0으로 조정합니다.
7. 코팅 완충액(3% 차단제 A): 500mL의 1x PBS에 차단제 A 15g을 추가합니다.
8. 세척 버퍼(0.05% Tween 20, PBST): 5000mL의 1x PBS에 2.5mL의 Tween 20을 추가합니다.
9. 판독 버....

결과

그림 1: 분석 양성의 컷오프를 결정하기 위한 ROC 곡선.85% 민감도에 해당하는 특이도의 99^번째 백분위수를 선택하여 0.023의 지수 값으로 표시하였다. 이 분석의 상한은 100개의 건강한 대조군에서 취해졌습니다.

....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인간 재조합 프로인슐린 단백질(PINS)	아미드바이오	인간 프로인슐린, Rec
인간 재조합 GAD65 단백질	디아미드	rhGAD65
인간 재조합 IA-2 단백질	크리에이티브 바이오마트	이아2
1x 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제10010-023
PBS 10개, pH 7.4	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	70011-044
소 혈청 알부민(BSA)	시그마-알로리치	A7906-500G
96웰 PCR 플레이트	어부	14230232
스트렙타비딘 코팅 플레이트	MSD (영문	L15SA
Zeba 사이징 스핀 컬럼	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	89890
트웬-20	어부	BP337-500
염산(HCl)	어부	A144-500
나오	어부	SS255-1 (영어
트리즈마 베이스	어부	BP152-5
EZ-Link 비오틴	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	PI21329
설포 태그	MSD (영문	R91AO-1
블로커 A	MSD (영문	R93AA-1
4x Read Buffer T(계면활성제 포함)	MSD (영문	R92TC-1
EZ-Link NHS-PEG4-비오틴	써모사이언스	21329
설포-TAG	MSD (영문	R91AO-1
96웰 중합효소연쇄반응(PCR) 플레이트	피셔 브랜드	14230232
96-웰 스트렙타비딘 플레이트	MSD 골드	패 15SA-1
Zeba 스핀 탈염 컬럼	써모사이언스	PL208984
96웰 플레이트 셰이커	퍼킨 엘머	1296-003
플레이트 리더	MSD (영문	퀵플렉스 SQ120
회전식 버킷이 있는 탁상형 원심분리기	베크만	알레그라 X-15R

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