$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 버퍼 준비
- 라벨링 완충액(인산염 완충 식염수(PBS) 2개, pH 7.9): 증류된 탈이온수(DD) 물 400mL에 10x PBS 100mL를 첨가하고 수산화나트륨(NaOH)으로 pH를 7.9로 조정합니다.
- 3mM의 비오틴: 1mg의 비오틴을 588μL의 라벨링 완충액에 용해시킵니다.
- 3 mM의 Sulfo-tag: 150 nmol의 Sulfo-tag를 50 μL의 라벨링 버퍼에 용해시킵니다.
- 항원 완충액(5% BSA): 1x PBS 500mL에 소 혈청 알부민(BSA) 25g을 첨가합니다.
- 0.5M 아세트산 용액을 준비합니다.
- 1.0M의 Tris-HCl 완충액 pH 9.0: 1M Tris-HCl 완충액을 준비하고 HCl로 pH를 9.0으로 조정합니다.
- 코팅 완충액(3% 차단제 A): 500mL의 1x PBS에 차단제 A 15g을 추가합니다.
- 세척 버퍼(0.05% Tween 20, PBST): 5000mL의 1x PBS에 2.5mL의 Tween 20을 추가합니다.
- 판독 버퍼(계면활성제가 포함된 2x Read Buffer T): DD 물 500mL에 계면활성제가 포함된 4x Read Buffer T 500mL를 추가합니다(재료 표).
- 비오틴과 설포-태그는 -20 °C 냉동고에 보관합니다.
메모: 비오틴(Biotin)과 설포태그(Sulfo-tag) 용액은 모두 라벨링 절차 직전에 항상 신선하게 준비해야 합니다.
2. Human Islet Autoantigen에 Biotin 및 Sulfo-tag 표시
참고: 보다 효율적인 라벨링 반응을 위해 고농도 항원(≥0.5mg/mL)이 권장됩니다.
- Biotin 및 Sulfo-tag에 대한 human islet autoantigen의 몰 비율을 측정합니다.
- 항원 중량을 분자량으로 나누어 항원 몰 수를 구합니다.
- 분자량이 더 작은 항원(≤10 kd)에는 1:5의 몰 비율을 사용하고, 분자량이 더 큰 항원(>50 kd)에는 1:20의 몰 비율을 사용합니다.
- Biotin 또는 Sulfo-tag의 부피를 어금니 수를 농도로 나누어 계산합니다.
- 인간 섬 자가항원을 1:5.
의 몰비로 Biotin 또는 Sulfo-tag와 혼합합니다.
메모: tris 또는 glycine buffer 시스템의 단백질은 sizing spin column을 사용하여 pH 7.9의 2x PBS buffer로 교환해야 합니다.
- 비오틴(Biotin)과 설포태그(Sulfo-tag)는 빛에 민감하기 때문에 반응 튜브를 알루미늄 호일로 덮습니다. 실온(RT)에서 1시간 동안 반응을 배양합니다.
- 배양 중에 2x PBS 버퍼를 컬럼에 세 번 분배하여 스핀 컬럼을 프라임합니다. 용액을 1000 x g에서 매번 2분 동안 원심분리합니다.
메모: 현재 브리징을 통한 라벨링 반응은 여전히 발생하고 있으며 중단해야 합니다.
- 라벨링된 human islet autoantigen을 정제하여 라벨링 반응을 중지합니다. 정제하려면 자가항원을 스핀 컬럼에 통과시키고 1000 x g에서 2분 동안 컬럼을 원심분리합니다.
- 항원 단백질의 양과 최종 부피를 사용하여 표지된 항원 농도(μg/μL)를 측정합니다.
메모: 대략적으로, 모든 스핀 컬럼 통과 후 표지된 항원의 90 - 95% 유지가 있을 것입니다.
- 표지된 항원을 분취하고 -80°C에서 표지된 항원을 보관합니다.
3. 분석에 대해 표지된 두 항원에 대한 최상의 농도 및 비율 정의(Checker Board Assay)
- 각각 총 부피가 200μL인 2개의 혈청 샘플(하나는 높은 양성 및 다른 하나는 음성)을 준비합니다.
- 4μL의 혈청을 분취하고 96웰 중합효소연쇄반응(PCR) 플레이트의 경우 최종 부피가 웰당 20μL가 될 때까지 1x PBS를 추가합니다. 그림 1A와 같이 플레이트의 절반은 높은 양성 샘플에 사용하고 나머지 절반은 음성 샘플에 사용합니다.
- 그림 1A와 같이 10μL의 비오틴(Biotin)과 10μL의 Sulfo-tag 표지 항원을 첨가하고 서로 다른 두 개의 표지된 항원에 대해 연속 희석을 수행합니다. 하나의 labeled antigen에 대해 수평 직렬 희석을 실행하고 다른 labeled antigen에 대해 수직 직렬 희석을 실행합니다.
- 5.3 - 9.1에 설명된 나머지 분석 단계를 계속합니다.
- 그림 1B에 표시된 음의 샘플에서 대응하는 각 신호에 대한 높은 포지티브 샘플의 신호 비율을 계산합니다.
- Biotin 및 Sulfo-tag 표지 항원에 대한 최상의 농도를 확인하려면 양성과 음성의 비율이 가장 높거나 거의 가장 높은 지점을 선택합니다. 비율을 식별하기 위해 음의 표본에서 나오는 낮은 백그라운드 신호를 고려하십시오.
메모: 분석 1일차에는 4단계부터 6단계까지 포함됩니다.
4. 비오틴/설포 태그 표지 항원의 올바른 농도를 사용하여 항원 완충액을 준비합니다
.
- checker board assay를 기준으로 각 항원의 합리적인 농도를 선택합니다.
- 항원 완충액에 대한 Biotin/Sulfo-tag 표지 항원의 합리적인 농도를 사용하여 플레이트당 3mL의 항원 용액을 준비합니다.
5. 표지된 항원으로 혈청 샘플 배양
참고: 이 섹션에는 두 가지 프로토콜이 있는데, 하나는 혈청산 치료를 하지 않는 것이고 다른 하나는 혈청 산 치료를 하는 것입니다. 인슐린 자가항체(IAA) 분석을 제외한 모든 islet 자가항체 분석은 5.1단계에서 5.5단계까지 혈청산 처리 없이 일반 프로토콜을 사용하는 반면, IAA 분석은 이 단계를 건너뛰고 5.6단계에서 5.9단계까지 혈청산 처리와 함께 프로토콜을 사용합니다.
- 4 μL의 혈청을 분취하고 96-well PCR 플레이트에 대해 최종 부피가 well당 20 μL가 될 때까지 1x PBS를 추가합니다.
- 웰당 20μL의 표지된 항원 용액을 추가합니다.
- 빛을 피하기 위해 PCR 플레이트를 밀봉 호일로 덮습니다.
- 접시를 RT에서 2시간 동안 셰이커(저속)에 올려 놓습니다.
- 플레이트를 4 °C 냉장고에 넣고 하룻밤 (18 - 24 시간) 배양합니다 .
메모: 5.6에서 5.9까지의 단계로 구성된 다음 프로토콜은 IAA 분석용으로만 설계되었으며 다른 자가항체 분석은 이 단계를 건너뜁니다.
- 각 혈청 샘플에 대해 15μL의 혈청과 18μL의 0.5M 아세트산을 혼합합니다. 이 혼합물을 RT에서 45분 동안 배양합니다.
- 항원 완충액을 사용하여 체커 보드 분석을 기반으로 Biotin 및 Sulfo-tag 표지 항원의 합리적인 농도로 항원 용액을 준비합니다. 각 웰에서 비오틴(Biotin) 및 설포 태그(Sulfo-tag) 표지 항원이 포함된 35μL의 항원 완충액을 새 PCR 플레이트에 분취합니다.
- 45분 배양(5.6단계) 단계가 완료되기 전에 항원 플레이트의 각 웰 측면에 8.3μL의 1M Tris pH 9.0 버퍼를 추가합니다(5.6단계). Tris 완충액과 항원 사이의 혼합을 제한하는 것이 중요합니다. 단계 5.6에서 산으로 처리된 혈청 25μL를 각 웰로 즉시 옮기고 용액을 교반합니다. 빛을 피하기 위해 PCR 플레이트를 밀봉 호일로 덮습니다.
- 접시를 셰이커(저속)에 올려 RT에서 2시간 동안 놓습니다.접시를 4°C 냉장고에 넣고 밤새 (18-24시간) 배양합니다.
6. 스트렙타비딘 플레이트 준비
- 4°C 냉장고에서 스트렙타비딘 플레이트를 가져와 플레이트가 RT로 오도록 합니다.
- 스트렙타비딘 플레이트가 RT에 도달하면, 각 웰에 150μL의 3% Blocker A를 추가합니다.
- PCR 플레이트를 밀봉 호일로 덮습니다.
- 플레이트를 4°C 냉장고에서 밤새 배양합니다.
참고: 분석 2일차에는 7단계부터 9단계까지 포함됩니다.
>7. 혈청/항원 배양을 Streptavidin 플레이트로 옮깁니다.
- 다음날 냉장고에서 스트렙타비딘 플레이트를 꺼내 플레이트의 버퍼를 버립니다. 마른 종이 타월을 테이블 위에 놓고 우물 내부에 완충액이 더 이상 없을 때까지 접시를 거꾸로 두드립니다.
- 빈 스트렙타비딘 플레이트에 웰당 150μL의 PBST를 채우고 플레이트에서 PBST를 버리고 총 3회 세척합니다.
- 웰당 30μL의 혈청/항원 인큐베이트를 스트렙타비딘 플레이트로 전달합니다.
- 빛을 피하기 위해 접시를 호일로 덮으십시오. 낮은 설정으로 RT에서 1시간 동안 플레이트를 흔듭니다.
8. 플레이트를 세척하고 읽기 버퍼를 추가합니다
.
- 플레이트에서 배양액을 버립니다. 웰당 150μL의 PBST를 추가하고 플레이트에서 PBST를 버리고 총 3회 세척합니다.
- 세척 후 Reading buffer.
웰당 150μL를 추가합니다.
메모: 용액에서 기포를 방지하는 것이 중요한데, 이는 플레이트 리더 기계에서 플레이트를 읽는 방법에 영향을 미치기 때문입니다.
