전기화학발광 분석을 사용한 human islet 자가항체 검출

초록

출처: Gu, Y. et al., 인간 섬 자가항체에 대한 전기화학발광 분석.J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오는 인간 혈청에서 섬 자가항체의 전기화학발광 검출을 보여줍니다. 혈청의 항체는 루테늄 접합 항원을 비오틴화 포획 항원에 연결하여 전기화학발광 측정으로 검출되는 복합체를 형성합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 버퍼 준비

1. 라벨링 완충액(인산염 완충 식염수(PBS) 2개, pH 7.9): 증류된 탈이온수(DD) 물 400mL에 10x PBS 100mL를 첨가하고 수산화나트륨(NaOH)으로 pH를 7.9로 조정합니다.
2. 3mM의 비오틴: 1mg의 비오틴을 588μL의 라벨링 완충액에 용해시킵니다.
3. 3 mM의 Sulfo-tag: 150 nmol의 Sulfo-tag를 50 μL의 라벨링 버퍼에 용해시킵니다.
4. 항원 완충액(5% BSA): 1x PBS 500mL에 소 혈청 알부민(BSA) 25g을 첨가합니다.
5. 0.5M 아세트산 용액을 준비합니다.
6. 1.0M의 Tris-HCl 완충액 pH 9.0: 1M Tris-HCl 완충액을 준비하고 HCl로 pH를 9.0으로 조정합니다.
7. 코팅 완충액(3% 차단제 A): 500mL의 1x PBS에 차단제 A 15g을 추가합니다.
8. 세척 버퍼(0.05% Tween 20, PBST): 5000mL의 1x PBS에 2.5mL의 Tween 20을 추가합니다.
9. 판독 버퍼(계면활성제가 포함된 2x Read Buffer T): DD 물 500mL에 계면활성제가 포함된 4x Read Buffer T 500mL를 추가합니다(재료 표).
10. 비오틴과 설포-태그는 -20 °C 냉동고에 보관합니다.
    메모: 비오틴(Biotin)과 설포태그(Sulfo-tag) 용액은 모두 라벨링 절차 직전에 항상 신선하게 준비해야 합니다.

2. Human Islet Autoantigen에 Biotin 및 Sulfo-tag 표시

참고: 보다 효율적인 라벨링 반응을 위해 고농도 항원(≥0.5mg/mL)이 권장됩니다.

1. Biotin 및 Sulfo-tag에 대한 human islet autoantigen의 몰 비율을 측정합니다.
   1. 항원 중량을 분자량으로 나누어 항원 몰 수를 구합니다.
   2. 분자량이 더 작은 항원(≤10 kd)에는 1:5의 몰 비율을 사용하고, 분자량이 더 큰 항원(>50 kd)에는 1:20의 몰 비율을 사용합니다.
   3. Biotin 또는 Sulfo-tag의 부피를 어금니 수를 농도로 나누어 계산합니다.
2. 인간 섬 자가항원을 1:5.
   의 몰비로 Biotin 또는 Sulfo-tag와 혼합합니다. 메모: tris 또는 glycine buffer 시스템의 단백질은 sizing spin column을 사용하여 pH 7.9의 2x PBS buffer로 교환해야 합니다.
3. 비오틴(Biotin)과 설포태그(Sulfo-tag)는 빛에 민감하기 때문에 반응 튜브를 알루미늄 호일로 덮습니다. 실온(RT)에서 1시간 동안 반응을 배양합니다.
4. 배양 중에 2x PBS 버퍼를 컬럼에 세 번 분배하여 스핀 컬럼을 프라임합니다. 용액을 1000 x g에서 매번 2분 동안 원심분리합니다.
   메모: 현재 브리징을 통한 라벨링 반응은 여전히 발생하고 있으며 중단해야 합니다.
5. 라벨링된 human islet autoantigen을 정제하여 라벨링 반응을 중지합니다. 정제하려면 자가항원을 스핀 컬럼에 통과시키고 1000 x g에서 2분 동안 컬럼을 원심분리합니다.
6. 항원 단백질의 양과 최종 부피를 사용하여 표지된 항원 농도(μg/μL)를 측정합니다.
   메모: 대략적으로, 모든 스핀 컬럼 통과 후 표지된 항원의 90 - 95% 유지가 있을 것입니다.
7. 표지된 항원을 분취하고 -80°C에서 표지된 항원을 보관합니다.

3. 분석에 대해 표지된 두 항원에 대한 최상의 농도 및 비율 정의(Checker Board Assay)

1. 각각 총 부피가 200μL인 2개의 혈청 샘플(하나는 높은 양성 및 다른 하나는 음성)을 준비합니다.
2. 4μL의 혈청을 분취하고 96웰 중합효소연쇄반응(PCR) 플레이트의 경우 최종 부피가 웰당 20μL가 될 때까지 1x PBS를 추가합니다. 그림 1A와 같이 플레이트의 절반은 높은 양성 샘플에 사용하고 나머지 절반은 음성 샘플에 사용합니다.
3. 그림 1A와 같이 10μL의 비오틴(Biotin)과 10μL의 Sulfo-tag 표지 항원을 첨가하고 서로 다른 두 개의 표지된 항원에 대해 연속 희석을 수행합니다. 하나의 labeled antigen에 대해 수평 직렬 희석을 실행하고 다른 labeled antigen에 대해 수직 직렬 희석을 실행합니다.
4. 5.3 - 9.1에 설명된 나머지 분석 단계를 계속합니다.
5. 그림 1B에 표시된 음의 샘플에서 대응하는 각 신호에 대한 높은 포지티브 샘플의 신호 비율을 계산합니다.
6. Biotin 및 Sulfo-tag 표지 항원에 대한 최상의 농도를 확인하려면 양성과 음성의 비율이 가장 높거나 거의 가장 높은 지점을 선택합니다. 비율을 식별하기 위해 음의 표본에서 나오는 낮은 백그라운드 신호를 고려하십시오.
   메모: 분석 1일차에는 4단계부터 6단계까지 포함됩니다.

4. 비오틴/설포 태그 표지 항원의 올바른 농도를 사용하여 항원 완충액을 준비합니다

.

1. checker board assay를 기준으로 각 항원의 합리적인 농도를 선택합니다.
2. 항원 완충액에 대한 Biotin/Sulfo-tag 표지 항원의 합리적인 농도를 사용하여 플레이트당 3mL의 항원 용액을 준비합니다.

5. 표지된 항원으로 혈청 샘플 배양

참고: 이 섹션에는 두 가지 프로토콜이 있는데, 하나는 혈청산 치료를 하지 않는 것이고 다른 하나는 혈청 산 치료를 하는 것입니다. 인슐린 자가항체(IAA) 분석을 제외한 모든 islet 자가항체 분석은 5.1단계에서 5.5단계까지 혈청산 처리 없이 일반 프로토콜을 사용하는 반면, IAA 분석은 이 단계를 건너뛰고 5.6단계에서 5.9단계까지 혈청산 처리와 함께 프로토콜을 사용합니다.

1. 4 μL의 혈청을 분취하고 96-well PCR 플레이트에 대해 최종 부피가 well당 20 μL가 될 때까지 1x PBS를 추가합니다.
2. 웰당 20μL의 표지된 항원 용액을 추가합니다.
3. 빛을 피하기 위해 PCR 플레이트를 밀봉 호일로 덮습니다.
4. 접시를 RT에서 2시간 동안 셰이커(저속)에 올려 놓습니다.
5. 플레이트를 4 °C 냉장고에 넣고 하룻밤 (18 - 24 시간) 배양합니다 .
   메모: 5.6에서 5.9까지의 단계로 구성된 다음 프로토콜은 IAA 분석용으로만 설계되었으며 다른 자가항체 분석은 이 단계를 건너뜁니다.
6. 각 혈청 샘플에 대해 15μL의 혈청과 18μL의 0.5M 아세트산을 혼합합니다. 이 혼합물을 RT에서 45분 동안 배양합니다.
7. 항원 완충액을 사용하여 체커 보드 분석을 기반으로 Biotin 및 Sulfo-tag 표지 항원의 합리적인 농도로 항원 용액을 준비합니다. 각 웰에서 비오틴(Biotin) 및 설포 태그(Sulfo-tag) 표지 항원이 포함된 35μL의 항원 완충액을 새 PCR 플레이트에 분취합니다.
8. 45분 배양(5.6단계) 단계가 완료되기 전에 항원 플레이트의 각 웰 측면에 8.3μL의 1M Tris pH 9.0 버퍼를 추가합니다(5.6단계). Tris 완충액과 항원 사이의 혼합을 제한하는 것이 중요합니다. 단계 5.6에서 산으로 처리된 혈청 25μL를 각 웰로 즉시 옮기고 용액을 교반합니다. 빛을 피하기 위해 PCR 플레이트를 밀봉 호일로 덮습니다.
9. 접시를 셰이커(저속)에 올려 RT에서 2시간 동안 놓습니다.접시를 4°C 냉장고에 넣고 밤새 (18-24시간) 배양합니다.

6. 스트렙타비딘 플레이트 준비

1. 4°C 냉장고에서 스트렙타비딘 플레이트를 가져와 플레이트가 RT로 오도록 합니다.
2. 스트렙타비딘 플레이트가 RT에 도달하면, 각 웰에 150μL의 3% Blocker A를 추가합니다.
3. PCR 플레이트를 밀봉 호일로 덮습니다.
4. 플레이트를 4°C 냉장고에서 밤새 배양합니다.
   참고: 분석 2일차에는 7단계부터 9단계까지 포함됩니다.

>7. 혈청/항원 배양을 Streptavidin 플레이트로 옮깁니다.

1. 다음날 냉장고에서 스트렙타비딘 플레이트를 꺼내 플레이트의 버퍼를 버립니다. 마른 종이 타월을 테이블 위에 놓고 우물 내부에 완충액이 더 이상 없을 때까지 접시를 거꾸로 두드립니다.
2. 빈 스트렙타비딘 플레이트에 웰당 150μL의 PBST를 채우고 플레이트에서 PBST를 버리고 총 3회 세척합니다.
3. 웰당 30μL의 혈청/항원 인큐베이트를 스트렙타비딘 플레이트로 전달합니다.
4. 빛을 피하기 위해 접시를 호일로 덮으십시오. 낮은 설정으로 RT에서 1시간 동안 플레이트를 흔듭니다.

8. 플레이트를 세척하고 읽기 버퍼를 추가합니다

.

1. 플레이트에서 배양액을 버립니다. 웰당 150μL의 PBST를 추가하고 플레이트에서 PBST를 버리고 총 3회 세척합니다.
2. 세척 후 Reading buffer.
   웰당 150μL를 추가합니다. 메모: 용액에서 기포를 방지하는 것이 중요한데, 이는 플레이트 리더 기계에서 플레이트를 읽는 방법에 영향을 미치기 때문입니다.

결과

그림 1: 분석 양성의 컷오프를 결정하기 위한 ROC 곡선.85% 민감도에 해당하는 특이도의 99^번째 백분위수를 선택하여 0.023의 지수 값으로 표시하였다. 이 분석의 상한은 100개의 건강한 대조군에서 취해졌습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인간 재조합 프로인슐린 단백질(PINS)	아미드바이오	인간 프로인슐린, Rec
인간 재조합 GAD65 단백질	디아미드	rhGAD65
인간 재조합 IA-2 단백질	크리에이티브 바이오마트	이아2
1x 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제10010-023
PBS 10개, pH 7.4	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	70011-044
소 혈청 알부민(BSA)	시그마-알로리치	A7906-500G
96웰 PCR 플레이트	어부	14230232
스트렙타비딘 코팅 플레이트	MSD (영문	L15SA
Zeba 사이징 스핀 컬럼	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	89890
트웬-20	어부	BP337-500
염산(HCl)	어부	A144-500
나오	어부	SS255-1 (영어
트리즈마 베이스	어부	BP152-5
EZ-Link 비오틴	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	PI21329
설포 태그	MSD (영문	R91AO-1
블로커 A	MSD (영문	R93AA-1
4x Read Buffer T(계면활성제 포함)	MSD (영문	R92TC-1
EZ-Link NHS-PEG4-비오틴	써모사이언스	21329
설포-TAG	MSD (영문	R91AO-1
96웰 중합효소연쇄반응(PCR) 플레이트	피셔 브랜드	14230232
96-웰 스트렙타비딘 플레이트	MSD 골드	패 15SA-1
Zeba 스핀 탈염 컬럼	써모사이언스	PL208984
96웰 플레이트 셰이커	퍼킨 엘머	1296-003
플레이트 리더	MSD (영문	퀵플렉스 SQ120
회전식 버킷이 있는 탁상형 원심분리기	베크만	알레그라 X-15R

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