면역글로불린 G 검출을 위한 종이 기반 면역 분석

초록

출처: Peng, Y. et al., 셀룰로오스 종이 디스크에 대한 항체의 공유 결합 및 육안 비색 면역분석에서의 응용.J. Vis. 특급 (2016)

이 비디오는 글루타르알데히드와 가교된 아민 기능성 셀룰로오스 디스크를 포함하는 종이 기반 면역 분석을 보여줍니다. IgG-Fc 특이적 포획 항체의 공유 고정화에 이어 면역글로불린 G 및 양고추냉이 과산화효소 접합 검출 항체를 도입하면 면역글로불린 G의 존재를 확인하는 색상 변화가 발생합니다.

프로토콜

1. 셀룰로오스 종이 디스크에 아민 작용기 접목

1. 1cm × 1cm 크기의 정사각형 종이 1장과 직경 6.0mm의 1등급 셀룰로오스 종이(중간 유동 여과지)로 만든 종이 디스크 100장을 구멍 펀치를 사용하여 준비합니다.
2. 종이 디스크에서 -NH₂ 그룹을 파생하려면 흄 후드의 50ml 유리병에 1ml의 3-아미노프로필트리메톡시실란(APS)과 10ml의 아세톤을 혼합합니다. 갓 준비된 APS 시약 혼합물에 종이 디스크를 넣고 실온에서 궤도 교반(200rpm)으로 5시간 동안 배양합니다.
   주의: 흄 후드에서 APS와 아세톤을 처리합니다.
3. 50ml 유리병에서 유기 폐기물 용기에 여분의 용액을 디캔트합니다.
4. 유리병에 아세톤 10ml를 넣고 잘 섞은 후 디캔팅하여 미반응 APS 및 기타 불순물을 제거합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.
5. 종이 타월에 종이 디스크를 펴고 110°C 오븐에 3시간 동안 넣습니다. 종이 디스크를 식히십시오. 디스크를 실온에서 50ml 원심분리기 튜브에 넣어 보관하십시오.
6. 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR)을 사용하여 아래 설명된 대로 셀룰로오스 정사각형 종이에 아민 그룹의 이식을 확인합니다(그림 1A).
   1. 컴퓨터를 켜고 FTIR 분광 기기를 엽니다.
   2. FTIR 분광법용 소프트웨어를 엽니다.
   3. 'Measurement → Initialize'로 이동합니다. 초기화가 완료되면 'BS: KBr', 'Lamp: Infrared' 및 'Laser'의 사각형이 녹색으로 바뀝니다.
   4. 사각형 아래의 '데이터'를 선택하고 '측정 모드', '아포디제이션', '스캔 수', '해상도' 및 '범위(cm-1)'에 대해 '%투과율', 'Happ-Genzel', '45', '4.0' 및 '최소: 400', '최대: 4000'을 선택합니다.
   5. '측정'을 클릭합니다.
   6. 배경 데이터로 '데이터 파일'을 선택합니다. 의견을 적어 두십시오.
   7. 'BKG'를 클릭하여 배경의 기준선을 가져옵니다.
   8. 필름 샘플 홀더에 정사각형 종이를 고정합니다.
   9. 샘플 데이터에 대해 '데이터 파일'을 선택합니다. 의견을 적어 두십시오.
   10. 'Sample'을 클릭하여 샘플의 스펙트럼을 얻습니다.
   11. FTIR 분광 응용 프로그램을 닫고 컴퓨터를 끕니다.
7. 위의 단계(단계 1.1-1.6)를 반복하여 아민 기능성 등급 No. 113 셀룰로오스 사각 종이 및 디스크(고속 흐름 여과지)를 준비하고 113 등급 정사각형 용지에 대한 FTIR 스펙트럼을 얻습니다(그림 1B).

2. 면역글로불린 G(IgG) 검출을 위한 종이 기반 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)

1. 20ml 유리병에 0.05% 글루타르알데히드 용액 5ml(50mM PBS 완충액, pH 7.4에서 준비)를 추가합니다. 이 용액에 아민 기능성 매체 흐름 여과지 디스크 15개를 담그고 실온에서 흔들면서 1시간 동안 유지합니다.
   1. 동시에 2.1단계를 반복하여 다른 15개의 알데히드 기능화 고속 흐름 여과지 디스크를 준비합니다.
      주의: 흄 후드에서 글루타르알데히드를 처리합니다.
2. 종이 디스크에서 미반응 글루타르알데히드를 제거하려면 15개의 중간 흐름 여과지 디스크를 15ml 원심분리기 튜브에 넣고 15개의 고속 흐름 여과지 디스크를 다른 15ml 원심분리기 튜브에 넣습니다. 각 튜브에 DI 워터 5ml를 넣고 튜브를 10초 동안 흔듭니다. 피펫으로 흡입하여 물을 제거하십시오. 두 번 반복하여 반응하지 않은 글루타르알데히드를 제거합니다.
3. 종이 디스크를 37 °C 오븐에서 말리십시오.
4. 각 매체 흐름 및 고속 흐름 여과지 디스크에 각각 5μl 및 8μl의 0.025mg/ml 마우스 IgG-Fc 단편 항체를 추가하고 20분 동안 배양합니다.
5. 항체를 제거하지 않고 각 종이 디스크에 10μl의 50mM PBS(pH 7.4)를 추가하고 아민 알데히드 반응을 위해 40분 동안 배양합니다.
6. 종이 타월 위에 0.2ml의 세탁 버퍼로 종이 디스크를 씻습니다. 세탁을 세 번 반복합니다.
7. 종이 디스크를 37°C의 오븐에서 건조시킵니다.
8. 15μl의 블로킹 버퍼로 종이 디스크를 실온에서 10분 동안 차단합니다.
9. 종이 타월 위에 0.2ml의 세탁 버퍼로 각 종이 디스크를 씻습니다. 세탁을 세 번 반복합니다.
10. IgG 표준을 실행합니다.
    1. 10μl의 다양한 IgG 농도(예: PBS의 경우 0, 10, 125, 250 및 500ng/ml)를 각 디스크에 3회씩 로드합니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
11. 종이 타월 위에 0.2ml의 세탁 버퍼로 종이 디스크를 씻습니다. 세탁을 세 번 반복합니다.
12. 10μl의 HRP 접합 마우스 IgG-Fc 단편 항체(1:10,000, 10mM PBS, pH 7.4)를 로드하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
13. 종이 타월 위에 0.2ml의 세탁 버퍼로 종이 디스크를 씻습니다. 세탁을 세 번 반복합니다.
    메모: 버퍼의 존재에 의해 결과가 영향을 받지 않으므로 세척 버퍼를 제거할 필요가 없습니다.
14. TMB와 과산화수소의 10μl 혼합물을 각 디스크에 로드합니다.
15. 배양 5분 후 디지털 카메라 또는 스마트폰으로 모든 종이 디스크의 이미지를 촬영합니다.
    메모: 그림 2A에서 '0'은 포획 항체 고정화로 처리된 종이 디스크와 IgG 혈청이 없는 항체-HRP/TMB 용액을 나타냅니다.
16. 이미지 J로 이미지에 있는 각 종이 디스크의 강도를 분석합니다.
    1. 3.15단계에서 촬영한 이미지를 '.tif' 형식으로 변환합니다.
    2. 'Image J' 소프트웨어를 엽니다.
    3. 'File → Open'으로 이동하여 분석할 이미지를 선택합니다.
    4. 모양 버튼 '타원'을 선택합니다.
    5. '이미지 → 유형 → 32비트'로 이동합니다.
    6. '편집 → 반전'으로 이동합니다.
    7. 'Analyze → Measure'로 이동합니다.
    8. 스프레드시트의 데이터를 복사하고 분석합니다.

결과

그림 1.처리되지 않은 및 APS 처리된 중간 흐름 필터 사각 종이(A) 및 고속 흐름 필터 사각 종이(B)의 푸리에 변환 적외선(FTIR) 스펙트럼. ᅡ. 처리되지 않은 매체 흐름 필터 사각 용지의 스펙트럼은 APS 처리된 중간 흐름 필터 정사각형 종이의 스펙트럼과 유사했습니다. APS 처리된 정사각형 종이에 대한 902-1,170 ^cm-1 및 1,210-1,500 ^cm-1 대역에서의 강도 증가는 각각 SiOC-H 그룹의 Si-O-셀룰로오스 및 C-H 변형에 속했습니다. 1,650 ^cm-1 및 2,885 ^cm-1에서 띠의 증가는 각각 식염수 프로필 부분에서 -NH₂

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
셀룰로오스 여과지, Grade1 (매체 흐름 여과지)	GE Healthcare Pte Ltd 싱가포르	1001년 110
셀룰로오스 여과지, Grade113 (빠른 흐름 여과지)	Sigma-Aldrich, 싱가포르	1113-320
3-아미노프로필트리메톡시실란	Sigma-Aldrich, 싱가포르	T1255	>96%
글루타르알데히드	Sigma-Aldrich, 싱가포르	G6257	2등급, H2O 25%
소 세럼 앨범	Sigma-Aldrich, 싱가포르	A2153
탈지 분유	루이 프랑수아		Packed by Kitchen Capers, 싱가포르
트리스 베이스	프로메가	H5135
소듐 오디에이트	머 크	106597
나2HPO4	머 크	106585
KH2PO4	머 크	104873
염화나트륨	칼바이오켐	567441
나오	머 크	106462
HCL	머 크	100317
인산염 완충액 식염수(PBS)	해당 사항 없음	해당 사항 없음	137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.0 mmol/L Na2HPO4 및 1.5 mmol/L KH2PO4를 함유하는 PBS는 물로 준비되고 0.1 mol/L NaOH 또는 0.1 mol/L HCl로 pH 7.4로 조정됩니다
아세톤	Tee Hai Chem Pte Ltd 싱가포르	9005-68
TMB와 과산화수소 용액의 혼합물	1-Step ultra TMB-ELISA 솔루션, Thermo Scientific Pierce	34029	1
친화력 정제 염소 항 마우스 IgG-Fc 코팅 항체	베틸 연구소, Inc	A90-131ᅡ
마우스 레퍼런스 세럼	베틸 연구소, Inc	RS10-101-5	9.5 mg/mL
HRP 접합 염소 항-마우스 IgG-Fc 검출 항체	베틸 연구소, Inc	A90-131P
설비
푸리에 변환 적외선 분광 광도계	시마즈 IR 프레스티지-21	해당 사항 없음
오븐	누브 FN500	해당 사항 없음
터보 믹서 VM-2000	MYC 주식회사	해당 사항 없음
이미지 J	RGB, 무료 다운로드	해당 사항 없음

호 년 . 년 호 리터 (영문)