Candida tropicalis Biofilm에 대한 항체의 효과를 평가하기 위한 체외 분석

초록

출처: Chandley, P., et al. 칸디다 트로피칼리스 생물막에 대한 항체의 효과를 평가하기 위한 용해성 테트라졸륨 기반 환원 분석법. J. Vis. 특급. (2022).

이 비디오는 곰팡이 생물막에 대한 항체의 효과를 연구하는 시험관 내 기술을 보여줍니다. 병원성 진균 Candida tropicalis는 aspartyl proteinase 2 (Sap2)를 분비하는 독성 인자를 분비하여 생물막 형성을 촉진합니다. 생물막 성숙을 억제하는 Sap2 특이적 항체를 함유한 열 불활성화 혈청을 도입하면 발색 분석을 사용하여 곰팡이 세포의 생존력을 평가합니다.

프로토콜

1. C. tropicalis 생물막 형성

1. 앞서 설명한 대로 바닥이 평평한 96웰 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트에서 칸디다 생물막을 준비합니다(그림 1).
2. 다채널 피펫을 사용하여 100μL의 C. tropicalis 배양액(위와 같이 준비된 10개의⁶ cells/mL 스톡에서)을 96웰 마이크로타이터 플레이트에 추가합니다(그림 2A). 마지막 두 열(11 및 12)은 진균 세포를 추가하지 않음으로써 '무균 플러스 세럼' 및 '무균 및 무혈청' 음성 대조군으로 유지합니다. 11열과 12열을 100μL의 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640 모르폴린프로판술폰산(MOPS) 배지 단독으로 채웁니다.
3. 마이크로타이터 플레이트를 뚜껑과 알루미늄 호일로 덮습니다. 정지 상태에서 37°C에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다.
4. 다음 날, 멀티채널 피펫을 사용하여 배지를 조심스럽게 흡인합니다(생물막을 건드리거나 방해하지 않음). 블로팅 시트의 거꾸로 플레이트를 가볍게 두드려 잔류 매체를 제거합니다.
5. 멀티채널 피펫을 사용하여 200μL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)(웰당)로 플레이트를 세척합니다. 생물막을 방해하지 않도록 웰의 측벽을 따라 PBS를 매우 부드럽게 첨가합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 PBS를 조심스럽게 흡입합니다. PBS 세척을 2회 반복합니다(총 3회 세척).
6. 과도한 PBS를 제거하려면 생물 안전 캐비닛 내부의 실온에서 플레이트(뚜껑 제외)를 30분 동안 자연 건조하십시오.

2. 항체를 이용한 생물막 처리

참고: 이제 항체에 의한 생물막 성숙 억제를 평가하기 위해 생물막을 처리할 수 있습니다. 쥐 혈청은 다클론 항체의 공급원으로 사용되었습니다. Sap2 면역 마우스와 함께 Sap2 면역 된 다른 그룹 (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis 및 Sap2-parapsilosis)을 역안와로 블리딩하고 혈청을 분리했습니다. 항-Sap2 항체의 존재는 Sap2-특이적 효소결합 면역흡착 분석법(Eliisa)을 사용하여 확인하였다.

1. 사용 전 56°C에서 30분 동안 혈청(다클론 항체의 공급원)을 열 비활성화하여 억제 활성에서 보체의 역할을 배제합니다. 혈청 희석을 만들기 전에 세럼을 가열비활성화합니다.
   메모: 가짜 면역 마우스, 전면역 마우스 및 Sap2 특이적 항체 고갈 혈청의 혈청을 추가 대조군으로 사용합니다. 항체 고갈 혈청은 이전 연구에 따라 제조되었습니다. 이 프로토콜에서 시험된 혈청에 대한 연속 희석액(1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1,600, 1:3,200, 1:6,400 및 1:12,800) 중 1:25, 1:50 및 1:100에서 생물막 성숙 억제가 관찰되었습니다. 따라서 1:50은 억제와 혈청 섭취 사이의 균형을 맞추기 위해 선택되었습니다.
2. 멸균 RPMI 1640 MOPS 배지(1:50)에서 열 불활성화 혈청 샘플의 연속 희석을 준비합니다. 모든 혈청 샘플에 대해 공통 혈청 희석액(1:50)을 사용하여 생물막 성숙 억제를 테스트합니다.
3. 선택한 혈청 희석 100μL를 96웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 각 샘플에 대해 첨부된 레이아웃에 따라 혈청 희석액을 중복으로 추가합니다(그림 2B).
   1. 열 10에서 혈청 희석액을 추가하지 마십시오. 진균 전용 양성 대조군에 대해 RPMI 1640 MOPS 배지만 추가합니다.
      메모: 10열, G1-G8 및 H1-H8 열은 처음에 RPMI-MOPS에 곰팡이 세포를 가지고 있었습니다. 그러나 RPMI-MOPS는 24시간 후에도 10열에 추가된 반면, 24시간 후에는 G1-G8 행이 PBS 대조군으로, H1-H8 행은 무혈청 대조군으로 작용했습니다.
   2. 열 11에서 모든 웰에 1:50 희석된 혈청을 추가하여 무진균 플러스 혈청 음성 대조군 역할을 합니다.
   3. 12열에서, 어떤 웰에도 혈청 희석액을 첨가하지 마십시오. 이것을 무균 무혈청 음성 대조군으로 유지하십시오.
4. 뚜껑과 알루미늄 호일로 접시를 덮습니다. 플레이트를 37 ° C에서 24 시간 동안 배양합니다.

3. 생물막 대사 활성 추정

1. 다음 날, 멀티채널 피펫을 사용하여 세럼을 조심스럽게 흡인합니다(바이오필름을 만지거나 방해하지 않음). 블로팅 시트의 거꾸로 플레이트를 가볍게 두드려 잔여 세럼을 제거합니다.
2. 멀티채널 피펫을 사용하여 200μL의 1x PBS(웰당)로 플레이트를 세척하고 웰의 측벽을 따라 PBS를 추가하여 생물막이 파괴되지 않도록 합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 PBS를 조심스럽게 흡입하고 PBS 세척을 2회 반복(총 3회 세척)합니다. 여분의 PBS를 건조시키기 위해 생물 안전 캐비닛 내부에서 실온에서 플레이트(뚜껑 제외)를 30분 동안 자연 건조합니다.
3. XTT (2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide)/menadione의 제조:
   1. 멸균 링거 락테이트에 XTT를 0.5g/L 용액으로 준비합니다. XTT 25mg을 필터 멸균 링거 락테이트 50mL에 녹입니다. 알루미늄 호일로 덮인 별도의 튜브에 10mL를 부분 표본으로 넣고 -80°C에서 보관합니다.
   2. 메나디온을 10mM 스톡으로 준비합니다. 8.6mg의 메나디온을 5mL의 아세톤에 용해시키고 50μL를 100개의 개별 마이크로튜브에 분배합니다. 부분 표본을 -80 °C에서 보관하십시오.
   3. XTT 10mL를 복용하고 1μL의 메나디온을 첨가하여 사용 직전에 XTT/메나디온 용액을 준비하여 1μM 작업 용액을 얻습니다.
4. 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰당 100μL의 XTT/메나디온 용액을 추가합니다. 뚜껑과 알루미늄 호일로 접시를 덮습니다. 어둠 속에서 37 ° C에서 2 시간 동안 플레이트를 배양합니다.
5. 각 웰에서 80μL의 착색된 상등액을 새로운 96웰 플레이트로 옮깁니다. 490nm에서 플레이트를 읽습니다.
6. 열 10(fungus-only positive control)에 있는 웰의 흡광도 값의 평균을 계산하며, 이는 방정식 (1)을 사용하여 각 혈청 샘플에 의한 생물막 억제 비율을 계산하기 위한 참조 값으로 사용됩니다
   % 생물막 억제 = 100 - × 100 (1)

결과

그림 1: 칸디다 트로피칼리스 생물막 이미징.(A) 도립 현미경을 사용하여 RPMI 매체를 제거한 후 96웰 마이크로타이터 플레이트 바닥에 형성된 Candida tropicalis 생물막의 시각화. 이미지는 명시야 현미경을 사용하여 캡처했습니다(염색은 사용되지 않음). (B) 크리스털 바이올렛 염색 후 96웰 마이크로타이터 플레이트 바닥에 형성된 C. tropicalis 생물막의 시각화. (C) 주사 전자 현미경을 사용하여 유리 슬라이드에 형성된 C. tropicalis 생물막의 시각화. 스케일 바 = 100μm(A,B), 10μm(

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
15 mL 코니컬 원심분리기 튜브	BD 팔콘	546021
PBS 1개	-	실험실에서 준비	염화나트륨 : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4 : 0.72 g KH2PO4 : 0.12 g 물 500mL. pH를 7.4로 조정
50 mL 코니컬 원심분리기 튜브	BD 팔콘	546041
96웰 마이크로타이터 플레이트	눕크	442404
부 화기	일반적인
메나디오네	시그마	M5625
Microtiter 플레이트 리더	일반적인
멀티채널 피펫 및 팁	일반적인
페트리 접시	타슨	제460090
링거 락테이트	-	실험실에서 준비	염화나트륨 0.6g 젖산나트륨 0.312g 염화칼륨 0.035g 염화칼슘 0.027g 물 100mL pH 7.0으로 조정
RPMI 1640 걸레	히미디어	AT180
증권 시세	인비트로젠	X6493

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