Jejunum cryosections에서 Tuft 세포를 시각화하기 위한 면역형광 기반 방법

Abstract

출처: Mizutani, Y. et al., 자유 부유 마우스 Jejunum cryosections에서 장 터프트 세포를 시각화하기 위한 안티-포스포-기르딘 항체 사용.J. Vis. 특급 (2018)

이 동영상은 자유 부유 마우스 jejunum 동결절편에서 장 다발 세포를 시각화하기 위한 면역형광 기반 방법을 보여줍니다. 장 융모 내에서, 확장된 붉은 뿌리 덩어리와 함께 내강 끝에서 녹색 형광의 공동 국소화는 다발 세포의 존재를 나타냅니다.

Protocol

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 준비

사항

1. 인산염 완충 식염수(PBS) 10L를 준비합니다.: 인산수소나트륨(_Na2HPO4·12H2O) 32.27g, 인산이수소나트륨(_NaH2PO4·_2H2O) 4.5g, 염화나트륨(NaCl) 80.0g을 초순수에 첨가하여 최종 부피 10L. 용액을 실온(RT)에 보관합니다.
2. 200mL의 PBS-T: 100μL의 폴리옥시에틸렌(10) 옥틸페닐 에테르를 사용하여 1.1단계에서 PBS 200mL를 최종 농도 0.05%(vol: vol)까지 준비합니다. RT에 보관하십시오.
3. 장갑을 끼고 보안경을 착용한 상태에서 10% 완충 중성 포르말린 용액에 15% 자당 50mL를 준비합니다: 10% 완충 중성 포르말린 용액(재료 표)에 7.5g의 자당을 첨가하여 최종 부피 50mL로 만듭니다. RT.
   매장 주의: 10% 완충 중성 포르말린 용액에 함유된 포름알데히드를 흡입 ....

Results

그림 1: cryosections
의 형태학적 보존을 위한 jejunum 절편의 젤라틴 충전 (A) 젤라틴으로 마우스 제주넘을 광내 충전하는 절차의 사진.(A1) 18게이지 직선 바늘의 비스듬한 끝은 장 벽을 뚫지 않도록 제거되었습니다. (A2) 완충된 중성 포르말린 용액(10%)을 잘린 제주눔의 한쪽 끝에 주입하여 장 내용물을 씻어내고 장 내강 표면을 고정시켰다. (A3) 액체 젤라틴으로 채워진 잘린 제주넘을 6-0 나일론 봉합사(검은색 화살표)를 사용하여 양쪽 끝을 결찰했다. (A4) 기존의 봉합사 매듭(검은색 화.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SLC : DDY 6 주 된 암컷 마우스	Chubu Kagaku Shizai	해당 없음
인산수소이나트륨 12-물(Na2HPO412H2O)	와코	Tel.: 196-02835
나트륨 dihydroenphosphate 이수화물 (NaH2PO42H2O	와코	Tel.: 199-02825
염화나트륨 (NaCl)	와코	Tel.: 199-10665
트리톤 X-100, 폴리옥시에틸렌(10) 옥틸페닐 에테르	카타야마 화학	해당 없음
자당	와코	Tel.: 190-00013
10% 완충 중성 포르말린 용액	무토 케미칼	20215	1.3 단계.
팔로이딘-형광 염료 접합체, Alexa Fluor 594 팔로이딘	써모피셔 사이언티픽	A12381
메탄올	나칼라이 테스크	21915-35
다피(4',6-디아미디노-2-페닐린돌, 디하이드로클로라이드)	써모피셔 사이언티픽	D1306 (영어
N.N-디메틸포름아미드(DMF)	나칼라이 테스크	13015-75
소 혈청 알부민	시그마	A9647-10G
18게이지 스테인리스강 스트레이트 니들	테루모	NN-1838R
U.S.P. 6-0, 60cm 나일론 컷 봉합사, Crownjun	고노 제작소	해당 없음
22게이지 날개 달린 바늘	테루모	SV-22DLK〈블랙〉
20mL 테루모 주사기	테루모	친위대-20ES
50 mL 원심분리기 튜브	증권 시세	91050
15 mL 이와키 원심분리기 튜브	이와키	2325-015
1.5mL 마이크로 시험관	별	RSV-MTT1.5
젤라틴 파우더, 젤라레 블랑	닛타 바이오랩	2809
동결 조직 표본용 임베딩 컴파운드, O.C.T. 컴파운드 118 mL 12개	사쿠라 파인테크	4583
크라이오 몰드, CRYO DISH No. 3, 125 개, 웰 크기 20 × 25 × 5 (mm)	쇼에이 작품의	재질 보기 1101-3
이소펜탄	나칼라이 테스크	26404-75
팔콘 세포 배양 접시 35 x 10mm Easy-Grip	코 닝	353001
항원 회수 용액 농축액, 표적 회수 용액 pH 9 10x	다코	S2367	4.2.2 단계에서 항원 회수 용액 농축
단백질 블록	다코	X0909	4.2.5의 차단 솔루션.
Phospho-Y1798 girdin (pY1798) 항체와 관련상품	면역생물학실험실(IBL) = X사	28143	Phospho-Y1798 girdin 항체 단계 4.2.6.
염소 항토끼 IgG(H+L) 고도로 교차 흡착된 2차 항체, Alexa Fluor 488	써모피셔 사이언티픽	A11034
Aquous 마운팅 미디어, Prolong Gold Antifade Mountant	써모피셔 사이언티픽	P36930
커버 슬립, Matsunami 마이크로 커버 유리 22 x 22 mm 100 개 두께 No.1	마쓰나미 유리	C022221
Entellan 현미경 검사용 새로운 자일렌 기반 마운팅 미디어	머크 밀리포어	107961
MAS 코팅 슬라이드 글라스 화이트	마쓰나미 유리	미마스-01
목제 Mappe KO 타입	쇼에이 작품의	99-40007
이멀젼 오일 518 F 형광 프리 20 ml	자이스	444960
피펫, 피펫맨 P (P2, P20, P200, P1000)	길슨	F144801, F123600, F123601, F123602
초순수 생산 시스템	어드밴텍	GS-590
플라스틱 장갑, 스타 니트릴 장갑	별	RSU-NGVM
저온 유지 장치	라이카 마이크로시스템즈	CM1950
급속 냉동고, SANYO Ultra Low	산요	MDF-382
쇼케이스 냉장고	일본 냉동고	NC-ME50EC
수조, Thermominder SDminiN(50°C에서 젤라틴 용해)	타이텍	제0068750-000
혼성화 인큐베이터(50°C에서 항원 회수용)	타이텍	HB-100
면역염색을 위한 배양 챔버	코스모 바이오	10할까
면역조직화학을 위한 Reciprocal shaker(실온용)	타이텍	NR-1
면역조직화학을 위한 상호 셰이커(4C용)	도쿄 리카 키카이	MMS-3010
실체 현미경(조직 취급용)	올림푸스	SZ61
실체 현미경(그림 1B)	라이카 마이크로시스템즈	M165FC
형광 현미경(그림 3)	니콘	E800
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경	자이스	LSM700