Jejunum cryosections에서 Tuft 세포를 시각화하기 위한 면역형광 기반 방법

Abstract

출처: Mizutani, Y. et al., 자유 부유 마우스 Jejunum cryosections에서 장 터프트 세포를 시각화하기 위한 안티-포스포-기르딘 항체 사용.J. Vis. 특급 (2018)

이 동영상은 자유 부유 마우스 jejunum 동결절편에서 장 다발 세포를 시각화하기 위한 면역형광 기반 방법을 보여줍니다. 장 융모 내에서, 확장된 붉은 뿌리 덩어리와 함께 내강 끝에서 녹색 형광의 공동 국소화는 다발 세포의 존재를 나타냅니다.

Protocol

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 준비

사항

1. 인산염 완충 식염수(PBS) 10L를 준비합니다.: 인산수소나트륨(_Na2HPO4·12H2O) 32.27g, 인산이수소나트륨(_NaH2PO4·_2H2O) 4.5g, 염화나트륨(NaCl) 80.0g을 초순수에 첨가하여 최종 부피 10L. 용액을 실온(RT)에 보관합니다.
2. 200mL의 PBS-T: 100μL의 폴리옥시에틸렌(10) 옥틸페닐 에테르를 사용하여 1.1단계에서 PBS 200mL를 최종 농도 0.05%(vol: vol)까지 준비합니다. RT에 보관하십시오.
3. 장갑을 끼고 보안경을 착용한 상태에서 10% 완충 중성 포르말린 용액에 15% 자당 50mL를 준비합니다: 10% 완충 중성 포르말린 용액(재료 표)에 7.5g의 자당을 첨가하여 최종 부피 50mL로 만듭니다. RT.
   매장 주의: 10% 완충 중성 포르말린 용액에 함유된 포름알데히드를 흡입 및/또는 피부/눈 접촉은 위험할 수 있습니다. 주의해서 다루십시오.
4. 1.5mL의 메탄올에 현탁액인 200 units/mL phalloidin-fluorescent dye conjugate stock solution: phalloidin-fluorescent dye conjugate (1 바이알, 동결건조 고체, excitation 및 emission 파장 내 300 units: 각각 581 nm 및 609 nm)를 준비합니다. 용액을 -20 °C의 어두운 곳에 보관하십시오.
5. 5mg/mL 4',6-디아미디노-2-페닐린돌, 디하이드로클로라이드(DAPI) 원액을 준비합니다: N, N-디메틸포름아미드(DMF) 2mL에 DAPI 10mg을 준비합니다. 용액을 -20 °C의 어두운 곳에 보관하십시오.
6. PBS에 5% 소 혈청 알부민(BSA)을 준비합니다: BSA 0.5g, PBS 10mL. 4 °C에서 보관하십시오.
7. 니퍼를 사용하여 18게이지 직선 바늘의 비스듬한 끝을 제거하고 바늘 내강을 통해 액체가 흐르도록 집게로 닙처 끝을 세로 방향으로 꼬집습니다(그림 1A1).
   메모: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

2. 동물해부와 여주눔의 격리

1. 마우스의 관류 고정
   1. 장갑을 착용하고 환기가 잘 되는 곳에서 작업하십시오.
   2. 100mL 유리 비커, 10% 완충 중성 포르말린 용액, 수술 도구(가위, 집게), 금속 트레이, 6-0 나일론 절단 봉합사, 1.7과 같이 준비된 18게이지 직선 바늘, 22게이지 날개 달린 바늘, 20mL 주사기를 준비합니다.
   3. 유리 비커에서 20mL 주사기에 10% 완충 중성 포르말린 용액 20mL를 넣고 22게이지 날개 달린 바늘을 배출구에 부착합니다.
   4. 50mL 원심분리 튜브에 PBS 20mL(최종 5% 젤라틴)에 젤라틴 분말 1g을 첨가하여 액체 젤라틴을 준비합니다. RT에서 15분 동안 담근 후 흔들지 않고 50°C의 수조에서 15분 동안 배양합니다.
   5. 젤라틴을 잠시 소용돌이치고 50°C에서 15분 더 배양하여 젤라틴을 완전히 녹입니다. 사용할 때까지 튜브를 RT로 두십시오.
   6. 자궁경부 탈구로 성인 쥐를 안락사시킵니다.
   7. 2.1.6단계의 마우스를 금속 트레이에 놓고 수술 도구를 사용하여 엔시폼 연골을 통해 피부를 작게 절개합니다.
   8. 양손으로 절개 부위를 확대하여 흉부와 복부 부위를 노출시킵니다.
   9. 복막을 열어 횡격막을 노출시킨 다음 양쪽의 횡격막을 엽니다.
   10. 양쪽의 앞쪽 겨드랑이 선을 따라 흉곽을 절개한 후 흉선 위치를 가로 방향으로 절개하여 심장을 노출시켜 흉벽을 제거합니다.
   11. 우심방의 귓바퀴를 작게 절개하여 혈액을 배출하고 좌심실 정점에 22게이지의 날개 달린 바늘을 삽입합니다. 플런저를 밀어 10% 완충된 중성 포르말린 용액으로 조직을 관류시킵니다.
   12. 골반의 장기를 노출시킨 후 항문에서 직장 끝을 잘라내고, 장간막을 절개하여 장과 몸을 분리한다.
   13. 제주눔을 분리하려면 위 전방의 항문 쪽에서 4cm 떨어진 곳에서 장을 자릅니다. 남은 소장의 항문 절반을 버립니다.
   14. 세척 절차를 용이하게 하기 위해 제주넘을 반으로 자릅니다. 20mL 주사기에 10% 완충된 중성 포르말린 용액 20mL를 넣고 1.7단계에서 준비한 18게이지 직선 바늘을 배출구에 부착합니다.
   15. 잘린 제주눔의 한쪽 끝에서 10% 완충된 중성 포르말린 용액을 주입하여 장 내용물을 씻어내고 장 내강 표면을 고정합니다(그림 1A2).
   16. 2.1.15 단계에서 설명한 대로 PBS를 주입하여 장 내강을 세척합니다.
   17. 2.1.15단계에서 설명한 대로 액체 젤라틴을 장 내강으로 플러시하여 PBS를 액체 젤라틴으로 대체합니다.
   18. 6-0 나일론 절단 봉합사를 사용하여 봉합 결찰로 잘린 제주눔의 한쪽 끝을 닫고, 제주넘에 액체 젤라틴을 채우고, 반대쪽 끝을 봉합사 결찰로 닫습니다(그림 1A3).
   19. 4개의 봉합사 매듭을 추가하여 소시지 모양의 제주눔 단면을 cryomold의 함몰된 부분에 맞춥니다(그림 1A4).
       메모: 20mm x 25mm x 5mm 함몰 단면을 가진 cryomolds의 경우 ~20mm 소시지와 같은 jejunum 단면이 바람직합니다.
   20. 조직을 10% 완충된 중성 포르말린 용액에 15% 자당 50mL에 4°C에서 하룻밤 동안 담그십시오.
       메모: 이러한 단계는 자당에 의한 동결 보호와 젤라틴과 조직의 포르말린에 의한 단백질 고정을 보장합니다. 포르말린 젤라틴 젤라틴은 RT에서 녹지 않는 반면 4 °C에서 고정되지 않은 젤라틴 젤라틴은 RT에서 녹습니다.

3. 젤라틴이 함유된 제주넘 티슈의 스냅 동결

1. 봉합사 매듭에서 제주넘을 절단하여 양쪽 끝이 결찰된 3개의 소시지 같은 제주눔 조각을 얻습니다(그림 1A4). 냉동 조직 표본 준비를 위한 임베딩 화합물을 추가하기 위해 소시지와 같은 조각을 cryomold에 정렬합니다.
2. 액체 질소로 냉각된 이소펜탄에서 극저온 몰드를 스냅 동결합니다. cryomolds는 -80 °C
   에서 보관하십시오. 참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.

4. 자유 부동 극저온 절편을 사용한 Tuft 세포의 면역 형광

1. 냉동 절편
   1. 저온 유지 챔버 온도(CT)와 물체 온도(OT)를 모두 -22°C로 설정합니다. 냉동 조직 블록을 저온 유지 챔버의 저온 몰드에 최소 15분 동안 놓습니다.
   2. 35mm 배양 접시에 PBS 3mL를 추가합니다.
   3. 냉동 몰드에서 얼어붙은 조직 블록을 제거하고 면도날로 블록을 반으로 잘라 제주눔의 횡단면을 노출시킵니다. 블록의 절반을 척(저온 유지 장치 어댑터)에 장착하여 면도날로 절단면을 절단합니다.
   4. 젤라틴으로 채워진 제주넘을 30μm 두께의 절편으로 나눕니다. 얼린 집게를 사용하여 4.1.2단계에서 준비한 35mm 배양 접시에 절편을 부드럽게 옮깁니다(그림 2B, 오른쪽).
2. 1차 항체의 적용
   1. 35mm 배양 접시의 자유 부유 섹션을 3mL PBS-T로 각각 5분씩 3회 3회 상호 셰이커로 가볍게 흔들어 세척합니다(약 36회/분).
   2. 항원 회수 용액 준비: 초순수 2.7mL에 항원 회수 용액 농축액 0.3mL(재료 표)를 넣습니다. 자유 부유 절편이 포함된 35mm 배양 접시에 항원 회수 용액 3mL를 추가합니다.
   3. 뚜껑을 닫고 비닐 테이프 스트립으로 접시와 뚜껑 사이의 틈을 밀봉하고 흔들지 않고 50 ° C의 혼성화 인큐베이터에서 3 시간 동안 배양합니다.
   4. 인큐베이터에서 접시를 꺼내 RT에서 20분 동안 식힙니다. 비닐 테이프를 제거한 후 PBS-T 3mL와 약한 흔들기로 각 5분씩 섹션을 3회 세척합니다.
   5. PBS-T를 흡입하고 단면에 차단 용액(Table of Materials)을 5방울 떨어뜨립니다. RT에서 5분 동안 가볍게 흔들어 배양합니다.
   6. 1차 항체 용액 준비: 5μL의 phospho-Y1798 girdin(pY1798) 항체와 함께 PBS에서 5% BSA 495μL(재료 표). 섹션에 500μL의 1차 항체 용액을 추가합니다(차단 용액을 제거할 필요가 없음).
   7. 접시를 가습된 배양실에 넣고 4°C에서 밤새 가볍게 흔들어 배양합니다.
      메모: 하룻밤 배양은 최대 3박까지 연장할 수 있습니다.
3. 2차 항체의 적용
   1. PBS-T 3mL에 각각 5분씩 3회 가볍게 흔들어 세척합니다.
   2. 희석된 DAPI 원액 준비: DAPI 원액 2μL(Step 1.5), PBS 998μL.
   3. 2차 항체 용액 만들기: PBS 내 5% BSA 476μL, 희석된 DAPI 용액 10.5μL, 팔로이딘-형광 염료 접합체 원액 12.5μL, 염소 항토끼 IgG-형광 염료 접합체 1μL(파장: 여기 496nm, 방출 520nm).
   4. PBS-T를 흡인시킨 후 2차 항체 용액을 도포하고 RT의 차광 배양 챔버에서 가벼운 흔들림으로 30분 동안 배양합니다.
   5. PBS-T 3mL와 약한 흔들기로 각 5분씩 3회 세척합니다.
   6. 최종 세척 후 PBS-T를 제거하고 폴리옥시에틸렌(10) 옥틸페닐 에테르가 없는 PBS 3mL로 교체합니다. 접시를 실체 현미경으로 옮깁니다.
   7. 200μL의 PBS를 MAS로 코팅된 흰색 유리 슬라이드의 중앙에 있는 액적에 놓고 P200 피펫 팁을 사용하여 접시에서 하나의 제주넘 섹션을 액적으로 옮깁니다.
   8. 실체 현미경에서 단면 정렬을 조정한 후 단면을 둘러싼 나머지 모든 PBS를 흡인합니다.
   9. 20μL의 수성 마운팅 미디어(Media)를 추가하고 미디어 위에 20 x 20mm 커버슬립을 놓습니다.
   10. 커버슬립 가장자리를 크실렌 기반 장착 매체로 즉시 밀봉합니다. 슬라이드를 나무 마페에 놓고 크실렌 기반 장착 매체가 2 - 3시간 동안 실온에서 응고되도록 합니다.
       메모: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 자일렌 기반 마운팅 미디어가 응고된 후, 슬라이드는 RT의 차광 슬라이드 박스에 2 - 3주 동안 보관할 수 있습니다.

5. 컨포칼 현미경 검사

1. 컨포칼 현미경의 63X 대물렌즈에 이멀젼 오일을 바릅니다. 커버슬립 슬라이드를 아래로 돌려 슬라이드를 s에 놓습니다.tage.
2. 레이저 파장 405, 488 및 555nm에서 획득한 TC 이미지를 디지털화하고 이미지를 tiff 형식(.tiff)으로 저장합니다.
   메모: 형광 염료에 적합한 검출 필터 세트를 선택합니다(즉, 여기/방출 최대값: 358/461 nm, 490/525 및 590/617).

Results

그림 1: cryosections
의 형태학적 보존을 위한 jejunum 절편의 젤라틴 충전 (A) 젤라틴으로 마우스 제주넘을 광내 충전하는 절차의 사진.(A1) 18게이지 직선 바늘의 비스듬한 끝은 장 벽을 뚫지 않도록 제거되었습니다. (A2) 완충된 중성 포르말린 용액(10%)을 잘린 제주눔의 한쪽 끝에 주입하여 장 내용물을 씻어내고 장 내강 표면을 고정시켰다. (A3) 액체 젤라틴으로 채워진 잘린 제주넘을 6-0 나일론 봉합사(검은색 화살표)를 사용하여 양쪽 끝을 결찰했다. (A4) 기존의 봉합사 매듭(검은색 화...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SLC : DDY 6 주 된 암컷 마우스	Chubu Kagaku Shizai	해당 없음
인산수소이나트륨 12-물(Na2HPO412H2O)	와코	Tel.: 196-02835
나트륨 dihydroenphosphate 이수화물 (NaH2PO42H2O	와코	Tel.: 199-02825
염화나트륨 (NaCl)	와코	Tel.: 199-10665
트리톤 X-100, 폴리옥시에틸렌(10) 옥틸페닐 에테르	카타야마 화학	해당 없음
자당	와코	Tel.: 190-00013
10% 완충 중성 포르말린 용액	무토 케미칼	20215	1.3 단계.
팔로이딘-형광 염료 접합체, Alexa Fluor 594 팔로이딘	써모피셔 사이언티픽	A12381
메탄올	나칼라이 테스크	21915-35
다피(4',6-디아미디노-2-페닐린돌, 디하이드로클로라이드)	써모피셔 사이언티픽	D1306 (영어
N.N-디메틸포름아미드(DMF)	나칼라이 테스크	13015-75
소 혈청 알부민	시그마	A9647-10G
18게이지 스테인리스강 스트레이트 니들	테루모	NN-1838R
U.S.P. 6-0, 60cm 나일론 컷 봉합사, Crownjun	고노 제작소	해당 없음
22게이지 날개 달린 바늘	테루모	SV-22DLK〈블랙〉
20mL 테루모 주사기	테루모	친위대-20ES
50 mL 원심분리기 튜브	증권 시세	91050
15 mL 이와키 원심분리기 튜브	이와키	2325-015
1.5mL 마이크로 시험관	별	RSV-MTT1.5
젤라틴 파우더, 젤라레 블랑	닛타 바이오랩	2809
동결 조직 표본용 임베딩 컴파운드, O.C.T. 컴파운드 118 mL 12개	사쿠라 파인테크	4583
크라이오 몰드, CRYO DISH No. 3, 125 개, 웰 크기 20 × 25 × 5 (mm)	쇼에이 작품의	재질 보기 1101-3
이소펜탄	나칼라이 테스크	26404-75
팔콘 세포 배양 접시 35 x 10mm Easy-Grip	코 닝	353001
항원 회수 용액 농축액, 표적 회수 용액 pH 9 10x	다코	S2367	4.2.2 단계에서 항원 회수 용액 농축
단백질 블록	다코	X0909	4.2.5의 차단 솔루션.
Phospho-Y1798 girdin (pY1798) 항체와 관련상품	면역생물학실험실(IBL) = X사	28143	Phospho-Y1798 girdin 항체 단계 4.2.6.
염소 항토끼 IgG(H+L) 고도로 교차 흡착된 2차 항체, Alexa Fluor 488	써모피셔 사이언티픽	A11034
Aquous 마운팅 미디어, Prolong Gold Antifade Mountant	써모피셔 사이언티픽	P36930
커버 슬립, Matsunami 마이크로 커버 유리 22 x 22 mm 100 개 두께 No.1	마쓰나미 유리	C022221
Entellan 현미경 검사용 새로운 자일렌 기반 마운팅 미디어	머크 밀리포어	107961
MAS 코팅 슬라이드 글라스 화이트	마쓰나미 유리	미마스-01
목제 Mappe KO 타입	쇼에이 작품의	99-40007
이멀젼 오일 518 F 형광 프리 20 ml	자이스	444960
피펫, 피펫맨 P (P2, P20, P200, P1000)	길슨	F144801, F123600, F123601, F123602
초순수 생산 시스템	어드밴텍	GS-590
플라스틱 장갑, 스타 니트릴 장갑	별	RSU-NGVM
저온 유지 장치	라이카 마이크로시스템즈	CM1950
급속 냉동고, SANYO Ultra Low	산요	MDF-382
쇼케이스 냉장고	일본 냉동고	NC-ME50EC
수조, Thermominder SDminiN(50°C에서 젤라틴 용해)	타이텍	제0068750-000
혼성화 인큐베이터(50°C에서 항원 회수용)	타이텍	HB-100
면역염색을 위한 배양 챔버	코스모 바이오	10할까
면역조직화학을 위한 Reciprocal shaker(실온용)	타이텍	NR-1
면역조직화학을 위한 상호 셰이커(4C용)	도쿄 리카 키카이	MMS-3010
실체 현미경(조직 취급용)	올림푸스	SZ61
실체 현미경(그림 1B)	라이카 마이크로시스템즈	M165FC
형광 현미경(그림 3)	니콘	E800
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경	자이스	LSM700