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1. 세포 및 기생충 배양
- 5% 이산화탄소(CO2)에서 37°C에서 10% 열 비활성화 FBS(소 태아 혈청) 및 항생제(100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신)가 보충된 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 배지에 포함된 25cm2 세포 배양 플라스크에서 American Type Culture Collection(CCL-7)의 LLC-MK2(Rhesus Monkey Kidney Epithelial) 세포를 성장시킵니다.
- 이전 프로토콜에 따라 LLC-MK2 세포를 Trypanosoma cruzi(Y 균주)로 감염시킵니다.
- LLC-MK2 감염 세포(5mL)의 상층액을 15mL 세포 배양 원뿔형 원심분리 튜브에 넣고 500 x g에서 10분, 22°C에서 원심분리하여 세포 파편을 낮춥니다. 튜브를 37°C에서 10분 동안 유지하여 트리포마스티고테스가 상층액으로 헤엄칠 수 있도록 합니다.
- 새로운 원뿔형 튜브에 상층액을 수집하고 22°C에서 15분 동안 2500 x g의 원심분리기를 사용합니다. 상등액을 버리고 기생충이 포함된 펠릿을 완전한 RPMI 배지에 재현탁시켜 Neubauer 챔버에서 세포를 계수하여 세포 밀도를 측정합니다.
2. 면역형광 프로토콜 제어
참고: 일단 고정되면 커버슬립이 포함된 플레이트를 1x 인산염 완충 식염수(PBS)(pH 7.2)에 4°C에서 일주일 동안 보관할 수 있습니다. 저장하려면 세포가 투과화 단계를 거치지 않은 것이 중요합니다.
- LLC-MK2 세포(2 x 10,4)를 RPMI 배지에 자외선(UV) 멸균 처리된 둥근 커버슬립이 포함된 24웰 플레이트에 16시간 동안 침전시킵니다.
- 감염된 세포의 경우, T. cruzi(항목 1.4)를 함유한 상등액을 각 웰에 비율(감염 다중성, MOI 10:1)에 첨가하고 감염 6시간 동안 그대로 둡니다. 감염된 세포와 감염되지 않은 세포가 포함된 커버슬립을 PBS 용액으로 5회 세척하고 실온(RT)에서 10분 동안 1x PBS(pH 7.2)에 2% 파라포름알데히드로 고정합니다.
- 커버슬립을 PBS 1개(pH 7.2)로 각각 5분씩 3회 세척합니다.
- 0.2% IGEPAL CA-630(옥틸페녹시폴리에톡시에탄올)을 1x PBS(PH 7.2)에 넣어 상온에서 10분 동안 커버슬립을 투과합니다.
- 커버 슬립을 5x PBS로 각각 5분 동안 세 번 세척합니다.
- 차단 용액(2% 소 혈청 알부민, 1x PBS의 BSA, pH 7.2)으로 RT에서 30분 동안 커버슬립을 배양합니다.
- 마우스 monoclonal anti-hnpa1 (anti-heterogeneous ribonucleoprotein-A1) (dilution 1:200) 또는 블로킹 용액에 희석된 mouse polyclonal anti-TcFAZ (anti-Trypanosoma cruzi flagellum attachment zone protein) (dilution 1:100) 항체를 사용하여 RT에서 30분 동안 커버슬립을 배양합니다.
- 커버 슬립을 5x PBS로 각각 5분 동안 세 번 세척합니다.
- Alexa Fluor 488(1:600)에 접합된 염소 항-마우스 IgG F(ab')2(H+L)와 Alexa 594(1:300)에 접합된 팔로이딘(phalloidin)과 함께 RT에서 30분 동안 커버슬립을 배양하여 차단 용액에 희석된 숙주 세포의 액틴 필라멘트(F-actin)를 염색합니다.
- 1x PBS(pH 7.2)로 각각 5분씩 3회 세척합니다.
- 슬라이드 표면에 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 매체가 있는 소량의 ProLong Gold 퇴색 방지 장착 시약을 도포합니다.
- 집게를 사용하여 기포가 형성되지 않도록 장착 매체의 커버슬립을 부드럽게 기울입니다. 건조되면 원하는 경우 커버슬립을 밀봉합니다.
3. 동일한 숙주에서 제기된 단클론 및 다클론 항체를 사용한 이중 라벨링 면역형광 프로토콜
- 위에서 설명한 2.1-2.6단계를 반복합니다.
- 감염 세포와 감염되지 않은 세포를 포함하는 커버슬립을 차단 용액에 희석한 사내 마우스 다클론 항-TcFAZ 항체(1:100)로 RT에서 30분 동안 배양합니다.
- 커버 슬립을 5x PBS로 각각 5분 동안 세 번 세척합니다.
- 차단 용액에 희석된 Alexa Fluor 647(1:600)에 접합된 염소 안티 마우스 IgG F(ab')2(H+L)를 사용하여 RT에서 30분 동안 커버슬립을 배양합니다.
- 커버 슬립을 5x PBS로 각각 5분 동안 세 번 세척합니다.
- 차단 용액에 희석된(0.12mg/mL) AffiniPure 토끼 안티 마우스 IgG(H+L)로 RT에서 30분 동안 두 번째 차단 단계를 수행합니다.
- 커버 슬립을 1x PBS (pH 7.2)로 각각 5 분 동안 세 번 세척합니다. 그런 다음 RT에서 30분 동안 마우스 단클론 항-hnRNP A1 IgG2b 항체(1:200)로 배양합니다.
- 커버 슬립을 5x PBS로 각각 5분 동안 세 번 세척합니다.
- Alexa Fluor 488(1:600)에 접합된 염소 항-마우스 IgG2b 항체와 차단 용액에 희석된 Alexa 594(1:300)에 접합된 팔로이딘으로 커버슬립을 30분 동안 배양합니다.
- 커버 슬립을 5x PBS로 각각 5분 동안 세 번 세척합니다.
- 위에서 설명한 2.8-2.10단계를 반복합니다.