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1. 자동화된 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC) 시스템을 사용한 친화성 크로마토그래피에 의한 항체 정제
참고: 다음 절차는 일반적으로 대부분의 자동화 시스템에 적용할 수 있습니다. 정제는 실온 또는 4°C(FPLC 시스템을 서늘한 실내에 보관하는 경우)에서 수행할 수 있습니다. 일련의 스카우팅 테스트를 수행하여 적절한 컬럼 매트릭스, 결합 완충액, 용리 완충액 및 pH를 포함한 최적의 정제 조건을 식별하여 컨디셔닝된 배지에서 정제된 항체를 최대한 회수할 수 있습니다(결과 섹션 참조). 최적의 조건은 정제되는 항체 또는 단백질에 따라 다릅니다. 정제는 자동화된 FPLC 시스템에서 수행되었습니다. 정제는 5ml Protein A 컬럼을 사용하여 실온에서 수행되었습니다.
- 초순수를 사용하여 다음 완충액을 준비하고 권장 pH로 조정한 다음 0.22μm 필터를 통해 여과합니다.
- 다음을 혼합하여 인산염 완충 식염수(PBS) pH 7.4(결합 완충액) 1L를 준비합니다: 0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.01 M Na2HPO4 및 0.001 M Kh2PO4. 버퍼를 필터링하기 전에 필요한 경우 pH를 조정하십시오.
- pH 2.7(용리 완충액) 0.1M 글리신-HCl 500ml를 준비합니다. 버퍼를 필터링하기 전에 pH를 조정하십시오.
- 50M Tris pH 1(중화 완충액) 9.0ml를 준비합니다.
- 컴퓨터와의 모든 시스템 전원 및 통신 연결이 이루어졌는지 확인하십시오. 장치는 소프트웨어 '시스템 제어' 모듈에서 볼 수 있어야 합니다. UV 셀이 280nm 파장으로 설정되어 있는지 확인합니다. 선택 사항: 연결되어 사용할 경우 pH 측정기를 보정합니다.
- A, B 및 샘플 펌프의 입구 튜브를 초순수에 담가 시스템을 세척합니다. 튜브에 공기가 있거나 시스템에 공기가 의심되는 경우 주사기로 펌프를 퍼지하십시오. 시스템 컨트롤러를 통한 수동 조작 또는 자동화된 방법을 통해 시스템을 물로 세척하십시오. 압력, 전도도, UV280 트레이싱 및 pH가 일관되게 유지되고 컬럼의 압력 한계가 제조업체의 사양에 따라 초과되지 않는지 확인합니다.
메모: 이상이 있으면 계속하기 전에 해결해야 하는 시스템의 공기 또는 막힘을 나타낼 수 있습니다.
- 시스템 컨트롤러 모듈에서 부하(샘플 루프 우회) 또는 주입(샘플 루프를 통해) 위치에서 펌프 A를 통해 수동으로 1ml/분으로 유량을 시작하여 컬럼 연결을 시작합니다. 컬럼 위치 주입구에서 시스템 튜빙을 분리하고 컬럼 주입구에 연결된 스토퍼를 제거합니다.
- 시스템 튜빙에서 물이 컬럼 상단의 드롭 방향으로 흐르도록 한 다음 시스템 튜빙을 컬럼에 부착합니다. 컬럼 주입구와 주입구 피팅에 물방울이 넘치면 기포가 없는 연결이 보장됩니다.
- 다운스트림 배출구에 컬럼 배출구를 부착하고 모든 피팅이 단단히 고정되어 있는지 확인합니다. 이제 컬럼이 시스템에 부착된 상태에서 컬럼 사양에 설명된 대로 최대 압력 한계 및 유량에 대한 한계를 초과하지 마십시오.
- 5개의 컬럼 부피(CV)의 물로 컬럼을 세척합니다. 필요한 경우 UV280 추적이 안정화될 때까지 컬럼 세척을 계속합니다.
- A의 입구 튜브를 결합 버퍼에, B의 흡입 튜브를 용리 버퍼에, 샘플 펌프를 결합 버퍼에 담궈 올바른 버퍼에서 시스템을 평형화합니다. 수동 작동으로 PumpWash를 사용하여 주입 튜브를 버퍼로 채웁니다.
- 소프트웨어의 'Method Editor' 모듈에서 Method 마법사를 사용하여 사용할 컬럼에 대한 친화성 크로마토그래피 Method를 설정합니다.
메모: 자동화된 FPLC 시스템에는 권장 설정(즉, 유속 및 압력 한계)이 미리 채워진 분석법과 함께 제공되며 정제를 위해 선택한 컬럼(제조업체, 매트릭스 및 크기)을 기반으로 단계를 실행합니다.
- 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 대해 다음 실행 단계를 사용합니다.
- 5 CV의 바인딩 버퍼로 시스템을 평형화하고 폐기물 용기로 흐름을 수집합니다.
- 샘플을 컬럼에 로드하고(로드할 볼륨은 Method에서 수동으로 지정됨) 플로우스루를 별도의 용기에 수집합니다.
- 5CV의 결합 완충액으로 시스템을 세척하고 흐름을 별도의 용기에 수집합니다.
- 용리 완충액을 사용하여 5 CV 등용매 분획으로 컬럼을 용리하고 분획 분취기에 의해 정제된 항체 시료를 분획으로 수집합니다.
- 5 CV의 바인딩 버퍼로 시스템을 평형화하고 폐기물 용기로 흐름을 수집합니다.
- Method가 설정되면 컬럼에 적용할 컨디셔닝된 미디어(Media)의 부피를 지정하고 Method.
를 저장합니다.
메모: 분석법에서 지정된 부피는 샘플 실행 중 공기 유입을 방지하기 위해 실제 부피보다 5-10ml 작아야 합니다. 이 프로토콜에 사용되는 지정된 부피는 90-120ml입니다.
- 샘플 펌프 튜브를 컨디셔닝된 매체가 들어 있는 용기에 담그십시오.
- 지정된 배출구 튜브를 통해 샘플 흐름을 수집하기 위해 별도의 용기를 준비합니다.
메모: 실행 중 오류가 발생하거나 컬럼의 결합 용량이 초과되어 플로우스루를 컬럼에 다시 적용해야 하거나 정제를 반복해야 하는 경우 플로우스루를 수집하는 것이 중요합니다.
- 분획 분취기(fraction collector)에서 수집 튜브를 준비합니다. 분획 부피 1ml당 100μl의 중화 완충액을 추가합니다. FPLC 시스템은 분획을 수집 튜브로 자동 용리합니다.
- 소프트웨어의 '시스템 제어' 모듈에서 실행할 메서드를 엽니다.
메모: 분석법 실행은 분석법의 변수 확인, 부분 수집기 설정, 결과 파일 이름 및 저장 위치 정의를 포함하는 일련의 페이지에서 시작됩니다.
- START를 클릭하여 실행을 시작합니다. 실행은 '시스템 제어' 모듈에서 모니터링할 수 있습니다.
- 정제 실행이 완료되면 시스템 소프트웨어의 '평가' 모듈에서 결과 크로마토그램을 확인합니다.
- 모든 단백질 함유 분획을 별도의 튜브에 결합하고, 30kDa 분자량 절단이 된 원심 필터 장치를 사용하여 PBS에서 완충액을 교환하고 농축합니다.제조업체의 지침에 따라 원심분리 단계를 수행합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 비신초닌산 분석법(BCA)을 사용하여 항체 농도를 측정합니다.
- 다른 정제 실행을 수행해야 하는 경우 sample 펌프 튜브를 결합 버퍼에 넣고 1.9-1.14단계를 반복합니다.
- 정제 실행이 완료되면 A, B 및 샘플 펌프의 주입 튜브를 초순수에 담그고 3단계에서 수행한 대로 시스템과 컬럼을 세척합니다.
- A, B 및 샘플 펌프 튜브를 20% 에탄올에 담그고 시스템과 컬럼을 보관하기 위해 세척 절차를 반복합니다.
- 다운스트림 배출구에서 컬럼을 분리하고 컬럼 스토퍼를 교체한 다음 주입구에서 컬럼을 분리하고 스토퍼를 교체하고 튜빙을 시스템에 다시 연결합니다. 컬럼을 4°C에서 보관하십시오.