성체 해마 신경 발생을 감지하기 위한 면역형광 염색 기법

초록

출처: Ansorg, A., et al. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis(성체 해마 신경 발생을 연구하기 위한 동일한 숙주 종의 항체를 사용한 면역조직화학 및 다중 라벨링). J. Vis. 특급 (2015)

이 비디오는 성인 해마의 신경 발생을 검사하는 데 사용되는 면역 형광 염색 방법을 보여줍니다. 초기에 쥐의 뇌 절편은 신경 전구 세포의 신경 발생과 관련된 마커 단백질을 겨냥한 1차 항체로 치료를 받습니다. 다음으로, 형광단으로 표지된 2차 항체로 표지됩니다. 그런 다음 뇌 단면을 컨포칼 현미경으로 관찰하여 마커 단백질의 뚜렷한 조합의 발현 패턴을 기반으로 전구 세포의 다양한 아형을 구별합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 조직 준비

1. 관류 전날 0.1M 인산염 완충액 pH 7.4에 4% 포름알데히드를 준비합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
2. 좌심을 통해 심부 마취된 마우스(3.5% 이소플루란)를 10ml 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 경심 관류한 다음 40ml 얼음처럼 차가운 포름알데히드(유속 5ml/분)를 투여합니다. 뇌를 해부하고 동일한 정착액에 4°C에서 24시간 동안 후수정(post-fix)합니다.
3. 뇌를 연속적으로 10%(4°C에서 24시간)와 30% 자당(뇌가 가라앉을 때까지, 약 48시간)으로 전환합니다. 동결을 위해 조직에서 거품이 나오지 않을 때까지 냉동 보호된 뇌를 -25°C 이소펜탄에 천천히 담그십시오. -80 °C에서 보관하십시오.
4. 얼어붙은 마이크로톰에서 40μm 두께의 코로나 절편을 절단합니다(-25 - -16 °C에서 블록 온도). 24웰 세포 배양 플레이트의 웰이 들어 있는 부동액 용액으로 절편을 순차적으로 옮깁니다(그림 1 참조). -20 °C에서 보관하십시오.

2. 면역 염색

참고: 단면은 일반적으로 캐리어 플레이트와 메쉬 인서트가 장착된 6웰 플레이트에서 자유롭게 부동하여 처리됩니다. 예외적으로, 차단, 항체 배양 및 아비딘-비오틴 복합체(ABC) 반응은 메쉬 인서트 없이 12웰 또는 24웰 플레이트에서 수행됩니다(염색해야 하는 슬라이스 수에 따라 웰당 0.5-1ml면 충분함). 이 단계에서 미세한 브러시를 사용하여 섹션을 옮깁니다(각각의 새 용액으로 헹굽니다). 모든 배양은 지속적인 교반(최대 150rpm)으로 수행됩니다.

1. 면역조직화학(ABC 방법)
   1. 부동액의 절편을 트리스 완충 식염수(TBS)로 옮기고 철저히 헹굽니다(4°C에서 O/N에 한 번, 실온[RT]에서 각각 10분씩 5회).
   2. 내인성 과산화효소 활성을 억제하기 위해 TBS-Tween 20(TBS-T)에서 1.5% H₂O₂에서 30분 동안 배양합니다. 필요한 경우 버블링 및 다시 잠기는 섹션에 주의하십시오. TBS에서 각각 3분씩 15회 헹굽니다.
   3. 선택 사항: 한편, 가열 캐비닛과 2N HCl을 37°C로 예열합니다. DNA를 변성시키려면, 2 N HCl에서 37 °C에서 30분 동안 절편을 배양합니다. 브러시를 사용하여 절편을 부드럽게 분리합니다.
   4. 선택 사항: 0.1M 붕산염 완충액 pH 8.5, RT에서 10분 동안 섹션을 중화합니다. 옮기는 동안 종이 타월에 섹션이 포함된 메쉬 삽입물을 짧게 닦아 HCl 찌꺼기를 제거합니다. TBS에서 각각 2분 동안 15회 헹굽니다.
   5. TBSplus에서 배양하여 조직을 투과화하고 RT에서 1시간 동안 비특이적 항체 결합 부위를 차단합니다.
   6. TBSplus에 희석된 1차 항체, O/N을 4°C에서 배양합니다. TBS에서 각각 15분씩 3회 헹굽니다.
   7. TBSplus에 희석된 비오틴화된 2차 항체를 RT에서 3시간 동안 배양합니다.TBS에서 각각 15분씩 3회 헹굽니다. 그동안...
   8. 제조업체의 프로토콜(TBS-T에서 1% A + 1% B)에 따라 ABC 복합체를 준비합니다. 사용하기 전에 RT에서 30분 동안 그대로 두십시오. RT에서 1시간 동안 AB 시약의 절편을 배양합니다. TBS에서 각각 15분 동안 3회 헹굽니다.
   9. 50웰 플레이트당 TBS-T에 0.5mg 또는 3,3'-Diaminobenzidine(DAB)을 6웰 또는 12웰 플레이트당 2ml로 나누어 각각 4ml 또는 2ml로 피펫팅합니다. 섹션을 DAB 솔루션으로 전송(주의! DAB는 독성이 있습니다. 공급업체가 제공하는 특정 MSDS를 따르십시오(예: 실험복과 장갑을 착용하고 화학 흄 후드를 사용).
   10. 나머지 25 ml DAB 용액에 0.5 ml 1%_H2O₂를 첨가하고, 위와 같이 등가 부피를 각 웰에 혼합하여 피펫 처리하여 과산화효소 반응을 시작한다. 12분 동안 배양합니다. TBS에서 각각 3분씩 15회 헹굽니다.
   11. 젤라틴과 공기 건조 O/N. 커버슬립에 영구 장착 매체가 있는 슬라이드에 섹션을 장착합니다.
   12. 선택 사항: 커버슬립을 배치하기 전에 대조 염색을 하십시오.
       메모: 백그라운드가 높아 신호 대 잡음비가 낮은 경우 AB 시약으로 배양한 후_H2O₂ 처리를 반복합니다(단계 2.1.8).
2. 다중 면역형광
   1. 단일 또는 동시 다중 면역형광
      1. 부동액의 단면을 TBS로 옮기고 부동액을 완전히 제거하기 위해 철저히 헹굽니다(4°C에서 O/N에 한 번, RT에서 각각 10분 동안 5회).
      2. 선택 사항: 2.1.3 - 2.1.4 단계로.
      3. TBSplus에서 배양하여 조직을 투과화하고 불특이적 항체 결합 부위를 차단합니다(RT에서 1시간).
      4. TBSplus에 희석한 1차 항체 칵테일(예: 랫드 α-BrdU(브로모데옥시우리딘), 기니피그 α-DCX(더블코르틴), 염소 α-GFP(녹색 형광 단백질))를 4°C에서 O/N으로 배양합니다. TBS에서 각각 15분씩 3회 헹굽니다.
      5. TBSplus에 희석한 형광 색소 접합 2차 항체(예: Rhodamine Red α-rat, Alexa-647 α-guinea pig, Alexa-488 α-goat, 모두 당나귀에서 유래)를 실온에서 3시간 또는 4°C에서 O/N으로 배양합니다. 이제부터 빛으로부터 섹션을 보호하십시오. TBS에서 각각 3분씩 15회 헹굽니다.
      6. 젤라틴으로 슬라이드에 섹션을 장착하고 밤새 자연 건조합니다(O/N). 수성 장착 매체가 있는 커버슬립.
   2. 동일한 숙주 종의 1차 항체를 사용한 순차적 다중 면역형광
      1. 2.2.1.1 - 2.2.1.3 단계로.
      2. 첫 번째 기본 항체 (예 : 토끼 α-항원 A), 4 ° C에서 O / N을 배양합니다. TBS에서 3 회, TBS-T에서 각각 10 분 동안 한 번 헹굽니다.
      3. 첫 번째 형광 색소 접합 2 차 항체 (예 : Rhodamine Red-conj. 당나귀 α-토끼)에서 3 시간 RT로 배양합니다. 이제부터 빛으로부터 섹션을 보호하십시오. TBS에서 3회, TBS-T에서 각각 10분씩 헹굽니다.
      4. 1차 항체(예: 토끼 혈청)와 동일한 숙주에서 10% 정상 혈청을 3시간 RT 동안 배양하여 첫 번째 2차 항체의 열린 파라톱스를 포화시킵니다. TBS에서 3회, TBS-T에서 각각 10분씩 헹굽니다.
      5. 4°C에서 두 번째 2차 항체인 O/N으로 인식할 수 있는 항원결정인자를 커버하기 위해 1차 항체(예: α-rabbit IgG(H+L))의 숙주에 대한 50 μg/ml 비접합 1가 Fab 단편을 TBSplus에서 배양합니다.
      6. TBS에서 최소 3회, TBS-T에서 각각 10분 동안 한 번 헹굽니다. 전송하는 동안 종이 타월로 섹션이 포함된 메쉬 삽입물을 간단히 닦아 Fab 찌꺼기를 제거합니다.
      7. 두 번째 1 차 항체 (예 : 토끼 α-항원 B), 4 ° C에서 O / N을 배양합니다. TBS에서 3 회, TBS-T에서 각각 10 분 동안 한 번 헹굽니다.
      8. 두 번째 형광 접합 2 차 항체 (예 : Alexa-488-conj. 당나귀 α-토끼)에서 3 시간 RT로 배양합니다. TBS에서 각각 15 분 동안 3 번 헹구고 위와 같이 마운트 및 커버 슬립합니다 .
         메모: 항원을 다른 숙주 종의 항체로 라벨링하려면 2.2.2.2 단계에 항원을 추가하고 2.2.2.3 단계에 해당 2 차 항체를 추가합니다.

결과

그림 1. 마이크로톰 슬라이스를 24웰 플레이트로 옮기는 개략도. A1에서 시작하여 후속 슬라이스를 행 A에 배치합니다. A6 다음에 다음 행 B로 이동하는 방식으로 이동합니다. D6에 도달하면 A1으로 돌아가서 계속합니다. 이러한 슬라이스의 배열은 전체 뇌의 모든 n^번째 섹션을 정량화할 수 있습니다. 신생아 세포의 정량화를 위해 6^번째 뇌 섹션 (한 열의 함량과 동일)을 취하십시오. 면역형광 표현형의 경우 12^번째 섹션마다 취합니다(한 열의 2개 교대 행 내용과 동일).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
조직 준비
이소플루란-악타비스	피라말 헬스케어	700211
파라포름알데히드 분말(PFA)	리델 드 하엔	16005	독성, 가연성
관류 펌프 PD5206	Heidolph 악기	Tel.: 523-52060-00
Masterflex Tygon 실험실 튜빙, Ø 0.8mm	Thermo Fischer Scientific	제06409-13
수유 바늘, 스트레이트, 21G, 올리브 팁 1.75mm, 40mm	아그토스	1036
냉동 마이크로톰 Microm HM 400	Thermo Fischer Scientific
24웰 세포 배양 멀티웰 플레이트	Greiner 바이오 원	662160
면역조직화학(Immunohistochemistry
테팔 비타퀴진스 찜통	테팔	VS 4001
Netwell 24mm 폴리에스테르 메쉬 멤브레인 인서트	코 닝	3479	6-well 배양 플레이트에 사전 적재
Netwell 15mm 폴리에스테르 메쉬 멤브레인 인서트	코 닝	3477	12웰 배양 플레이트에 사전 적재
Netwell 플라스틱 6웰 캐리어 키트	코 닝	3521	24mm 폴리에스테르 메쉬 멤브레인 인서트용
Netwell 플라스틱 12웰 캐리어 키트	코 닝	3520	15mm 폴리에스테르 메쉬 멤브레인 인서트용
Vectastain Elite ABC 키트	벡터 연구소	PK-6100
DAB(3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드 수화물)	시그마-알드리치	D-5637	발암성, 빛에 민감함
플루오로마운트-G	서던바이오텍	제0100-01
1차 항체
토끼 IgG1 α-Ki67
토끼 α-GFAP, AS-3-GF	노보카스트라/라이카 바이오시스템즈	NCL-L-Ki67MM1	DAB 1:400/IF 1:100; 에피토프 회수 필요
염소 IgG (H+L) α-GFP	시냅스 시스템	173 002	09:20h
마우스 IgG1 α-nestin	Acris 항체와 관련상품	R1091P	06:00h
기니피그 IgG (H+L) α-Doublecortin	아브캠	AB6142	1:200; 에피토프 회수 필요
쥐 IgG2a α-BrdU (복수)	머크 밀리포어	AB2253	09:20h
쥐 IgG2a α-BrdU (순화)	AbD 세로텍/바이오 라드	OBT0030CX	BrdU의 탐지를 위해; DAB 1:500/IF 1:400
마우스 IgG1κ α-BrdU	AbD 세로텍/바이오 라드	OBT0030	CldU의 탐지를 위해; DAB 1:500/IF 1:250-400
마우스 IgG1 α-NeuN	BD 바이오사이언스	347580	IdU 탐지용; DAB 1:500/IF 1:350
2차 항체	머크 밀리포어	MAB377	09:20h
당나귀 α-기니피그 IgG (H+L)-비오틴
당나귀 α-쥐 IgG (H+L)-비오틴	디아노바	전화: 711-065-152	09:20h
당나귀 α-마우스 IgG (H+L)-비오틴	디아노바	전화: 712-065-150	09:20h
염소 α-쥐 IgG(H+L)-Alexa Fluor 488	디아노바	전화: 715-065-151	09:20h
당나귀 α-염소 IgG(H+L)-Alexa Fluor 488	분자 프로브	A11006	05:10h
당나귀 α-마우스 IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment	분자 프로브	A11055	05:10h
당나귀 α-마우스 IgG(H+L)-Alexa Fluor 647	디아노바	Tel.: 715-097-003	02:40h
당나귀 α-기니피그 IgG(H+L)-Alexa Fluor 647	디아노바	Tel.: 715-605-151	05:10h
당나귀 α-rat IgG (H+L)-로다민 레드-X	디아노바	전화: 706-605-148	05:10h
당나귀 α-토끼 IgG (H+L)-로다민 레드-X	디아노바	전화: 712-295-150	05:10h
당나귀 α-기니피그 IgG (H+L)-로다민 레드-X	디아노바	Tel.: 711-295-152	05:10h
스트렙타비딘-로다민 레드-X	디아노바	Tel.: 706-296-148	05:10h
염소 α-토끼 IgG (H+L)-AMCA	디아노바	TEL.016-290-084	09:20h
회스트: 33342	디아노바	Tel.: 111-155-144	1:250, 토끼 α-GFAP에서만 작동합니다
다피	분자 프로브	H3570	17:40h
블로킹	분자 프로브	D1306 (영어	17:40h
팹 파편(Fab-fragment) 당나귀 α-마우스 IgG (H+L)
팹 파편 당나귀 α-토끼 IgG (H+L)	디아노바	Tel.: 715-007-003	1시 20
일반 당나귀 세럼	디아노바	Tel.: 711-007-003	1시 20
노멀 래빗 세럼	머크 밀리포어	시즌 30
노멀 염소 세럼	디아노바	TEL: 011-000-010
소 세럼 알부민	디아노바	TEL.005-000-001
조직학	시그마-알드리치	A7906
크레실 바이올렛
네오 클리어	시그마-알드리치	C5042
네오 마운트	머크 밀리포어	109843	무독성 크실렌 대체물
현미경 검사 법	머크 밀리포어	109016	영구 장착 매체
악시오스코프 2
LSM 710 (영문	Carl Zeiss 현미경 검사
	Carl Zeiss 현미경 검사

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