단백질의 세포 내 국소화를 시각화하기 위한 면역 라벨링 기법

Abstract

출처: Aishwarya, R., et al. 양자 점 매개 면역 표지 후 투과 전자 현미경을 사용하여 심장 단백질의 세포 내 국소화 시각화. J. Vis. 특급. (2022).

이 비디오는 양자점을 사용하여 쥐 심장 조직 절편에서 시그마-1 수용체의 면역 표지 기술을 보여줍니다. 심장 조직은 고정되고, 진동화되고, 염색되고, 탈수되고, 수지에 삽입된 다음 절단됩니다. 그런 다음 절편을 항체로 처리하고 양자 점으로 표시하여 전자 현미경을 사용하여 Sigma-1 수용체의 세포 내 국소화를 구분합니다.

Protocol

1. 동물 준비

1. 3% 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취합니다. 중간 복부 위 부위를 수평 절개하여 피부를 당겨 가슴을 엽니다. 다른 장기에 구멍을 뚫지 않고 흉강을 열기 위해 조심스럽게 한 번 더 절개합니다.
   1. 먼저 정점을 통해 심장을 관류한 다음 심정지 용액(50mM KCl, PBS의 5% 포도당, 표 1 참조)에 담긴 차가운 3% 글루타르알데히드를 사용하여 2분 동안 완전한 심근 이완을 보장합니다.
2. 0.1M의 카코딜산 나트륨 완충액(pH 7.4)에 얼음처럼 차가운 3% 글루타르알데히드를 사용하여 2분 더 심장을 관류합니다.중력 압력을 사용하여 25G 5/8" 바늘을 사용하여 고정제를 심장에 주입합니다. 심장에 고정제가 가득 차기 시작한 직후, 심장의 정점을 들어 올리고 심장에서 1-2mm 떨어진 아래의 혈관을 잘라 압력을 완화하고 액체가 배출되도록 합니다.
3. 심장을 절개하고 심실을 제거한 다음 심실을 페트리 접시에 담아 얼음처럼 차가운 3% 글루타르알데히드/0.1M 카코딜산나트륨으로 떨어뜨립니다. 고정 30-60분 후 나비 절단을 만들고 3% 글루타르알데히드/카코딜레이트가 함유된 페트리 접시에 넣습니다(재료 표 참조). 글루타르알데히드/카코딜레이트 용액에 있는 동안 수술용 칼날을 사용하여 1mm³의 작은 입방체로 심장을 자릅니다.
4. 절개된 심장 조직을 글루타르알데히드/카코딜레이트 용액에 4°C에서 24시간 동안 고정/담그십시오.

2. 심장 조직 처리

1. 고정 24시간 후 0.1M의 카코딜산 나트륨 완충액으로 조직을 20분 동안 세척합니다.
   1. 아래 단계에 따라 0.1M 카코딜레이트 완충액을 준비합니다.
      1. 0.1M 카코딜레이트 나트륨 완충액을 준비하려면 카코딜산 나트륨(21.4g)과 1% 염화칼슘 용액(3mL)을 증류수 90mL에 용해시켜 1M 카코딜레이트 나트륨 완충액을 준비합니다. 증류수를 추가하여 용액을 100mL로 부피를 늘립니다. 용액을 잘 저어주고 용질을 녹이기 위해 밤새 그대로 두십시오.
      2. 다음으로, 1M 카코딜레이트 나트륨 원액 10mL를 증류수 80mL에 넣습니다. HCl을 사용하여 pH를 7.4로 조정하고 증류수를 첨가하여 최대 100mL까지 부피를 조절합니다.
2. 0.1M 카코딜레이트 나트륨 완충액에서 20분 더 세척을 반복합니다. 카코딜레이트 나트륨 완충액에서 조직을 제거하고 실온에서 4시간 동안 2% 사산화오스뮴 용액에 담그십시오. 이 과정을 오즈메이션(osmication)이라고 합니다.
   1. 아래 단계에 따라 2% 사산화오스뮴 용액을 준비합니다.
      1. 2% 사산화오스뮴 용액을 준비하려면 4% 사산화오스뮴 용액, 4mL(재료 표 참조), 1M 카코딜레이트 나트륨 원액(0.8mL) 및 증류수(3.2mL)를 사용하여 총 8mL 용액을 만듭니다.
         메모: 이 전체 프로세스와 이후의 단계는 흄 후드에서 수행해야 합니다.
3. 발화 후 실온에서 10분 동안 2% 아세트산나트륨 용액에 조직을 담그십시오.
   1. 증류수 20mL에 아세트산나트륨 4g을 용해시켜 2% 아세트산나트륨 용액을 준비합니다.
4. 다음으로, 실온에서 1 시간 동안 2 % 우라닐 아세테이트 용액에 조직을 담그십시오.
   1. 증류수 20mL에 우라닐 아세테이트 4g을 용해시켜 2% 우라닐 아세테이트 용액을 준비합니다.
5. 우라닐 아세테이트 염색 후 표 2에 언급된 순서대로 등급이 매겨진 알코올과 아세톤을 통해 조직을 순차적으로 탈수합니다.

3. 심장 조직 임베딩

1. 아래 단계에 따라 탈수된 조직을 저점도 에폭시 수지에 삽입합니다.
   1. 저점도 에폭시 수지를 만들려면 50mL 튜브에 비닐 시클로헥센 이산화물 에폭시 단량체 10.24mL, 폴리프로필렌 글리콜(DER 732)의 디글리시딜 에테르 6.74mL, 노네닐 숙신산 무수물(NSA) 30.05mL(재료 표 참조)를 혼합합니다. 현탁액을 손으로 2분 동안 잘 저어줍니다.
   2. 2-디메틸아미노에탄올(DMAE, 재료 표 참조) 에폭시 촉진제 18방울을 추가하고 현탁액을 저어 성분을 완전히 혼합합니다.
   3. 다음 혼합물 순서로 조직을 에폭시 수지에 함침시킵니다.
      1. 100% 아세톤을 1:1 수지: 아세톤 현탁액으로 교체하고 실온에서 1시간 동안 조직을 담그십시오.
      2. 1:1 수지: 아세톤 현탁액을 6:1 수지: 아세톤 현탁액으로 교체하고 조직을 3시간 동안 담급니다.
      3. 마지막으로 6:1 수지: 아세톤 현탁액을 100% 수지 현탁액으로 교체하고 조직을 실온에서 밤새 담근 상태로 둡니다.
2. 조직을 8mm 마이크로 몰드(재료 표 참조)의 새 수지에 넣고 내장된 조직을 70°C에서 하룻밤 동안 경화시킵니다.
   메모: 수지가 단단하지만 경화 후 부서지기 쉽지 않은지 확인하십시오.

4. 초박 절편을 이용한 조직 절편

1. 초박 절편기에 장착하기 전에 조직이 있는 수지 블록을 1mm 이하로 자릅니다(재료 표 참조). 초박 절편기의 분절된 암에 주형을 가능한 한 정확하게 놓고 샘플 주형을 다이아몬드 나이프 쪽으로 수동으로 전진시킵니다.
2. Histo 나이프(재료 표 참조)를 사용하여 500nm(1/2미크론) 두께로 섹션을 자르고 EM 루프 도구를 사용하여 단면을 집어 유리 슬라이드에 놓습니다.
3. 관심 영역을 찾기 위해 toluidine blue stain에 대한 핫 플레이트에 유리 슬라이드를 놓습니다.
4. 관심 영역을 찾은 후 Ultra 45° 나이프(재료 표 참조)를 사용하여 옅은 금색의 초박형 절편(100nm)을 만듭니다. 이 초박형 섹션을 200메쉬 구리 그리드의 둔한 쪽에 배치합니다.

5. 초박형 심장 단면 염색

1. 에칭 용액, 즉 5% 메타요오디에이트나트륨 용액을 사용하여 항원의 가면을 벗겨 염색을 시작합니다.
   1. 증류수에 500μL의 5% 메타주산나트륨(재료 표 참조) 용액을 준비합니다.
      메모: 사용하기 전에 새 용액을 준비하십시오.
   2. 깨끗한 파라핀 필름에 20μL의 메타골판나트륨 용액을 넣습니다. 조직 절편이 있는 완전히 건조된 그리드를 에칭 용액의 액적에 놓습니다.
      메모: 조직 섹션이 있는 그리드의 무딘 면은 에칭 용액을 향해야 합니다.
   3. 실온에서 30분 동안 용액의 단면 그리드를 그대로 두십시오.
2. 에칭된 조직 부분을 증류수 한 방울에 60초 동안 올려 놓아 세척합니다.
3. 실온에서 10분 동안 0.05M 글리신 용액 방울에 단면 그리드를 배치하여 잔류 알데히드를 차단합니다. 잔류 글리신 용액을 제거하기 위해 여과지에 그리드의 가장자리를 닦습니다.
   1. 1x PBS(pH 7.4) 1mL에 글리신 3.75mg을 용해하여 0.05M 글리신 용액(재료 표 참조)을 준비합니다.
4. 단면 그리드를 실온에서 25분 동안 10-20μL의 차단 용액에 놓습니다.
   메모: 차단 용액 조성: 1% 정상 염소 혈청(NGS) 2μL + 1% BSA 20μL(최종 농도: 10%) + 1x PBS 178μL(pH 7.4)로 최종 부피 200μL를 만듭니다.
5. 여과지에 그리드 가장자리를 닦아내고 그리드 섹션을 항체 희석제에 올려 실온에서 10분 동안 컨디셔닝합니다.
6. 가습된 챔버에서 1시간 30분 동안 1차 항체(이 경우 Sigmar1, Table of Materials(표 참조, 항체 희석제에 1:10으로 희석됨))로 그리드 섹션을 배양합니다.
7. 그리드를 블로핑으로 건조시키고 항체 희석제로 그리드 섹션을 각각 5분씩 두 번씩 세척합니다.
8. 가습된 챔버에서 1시간 동안 비오틴화된 2차 항체(이 경우, 비오틴화된 염소 항토끼 다클론 2차 항체, 재료 표 참조, 항체 희석제에 1:10으로 희석됨)로 그리드 절편을 배양합니다.
9. 그리드를 블로핑으로 건조시키고 항체 희석제로 그리드 섹션을 각각 5분씩 두 번씩 세척합니다.
10. 시판되는 streptavidin-conjugated QD(QD_655nm, 재료 표 참조, 항체 희석제에 1:10으로 희석됨)에서 그리드 섹션을 실온의 가습 챔버에서 1시간 동안 배양합니다. 챔버를 알루미늄 호일로 덮어 빛에 노출되는 것을 방지하십시오.
11. 여과지를 사용하여 그리드 가장자리를 닦아내고 건조시킨 다음 그리드 섹션을 물방울에 2분 동안 올려 씻습니다.
12. 그리드의 가장자리를 닦아 건조시킵니다.

표 1: 조직 탈수에 사용되는 PBS 및 기타 용액의 구성.

완충기	구성	양
인산염 완충 식염수(PBS) (1x) (1 L)	소금	8 지
	염화칼륨	0.2 지
	인산나트륨 이염기성	1.44 지
	인산칼륨 monobasic	0.24 지
	pH를 7.4로 조정합니다.

표 2: 조직 탈수를 위한 등급 알코올 및 아세톤 적용(2.5단계)

분 분 분 분 분 분 분

구성 요소	시간
50% 에탄올	10
70% 에탄올	10
95% 에탄올	10
100% 에탄올	20
100% 에탄올	20
100% 아세톤	30
100% 아세톤	30

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 메쉬 구리 그리드	테드 펠라	G200HH
FVB/N 배경을 가진 6개월 된 수컷 마우스	잭슨 연구소, 메인 주 바 하버
아세톤 100%	피셔 화학 물질	A949
항체 희석제	다코	S3022
anti-Sigmar1 항체	세포 신호 전달	61994 초
비오틴화 염소 항토끼 IgG 항체	시그마 알드리치	B7389
BSAc (10%)	전자 현미경 과학	25557
염화칼슘	시그마 알드리치	C7902
사이토씰 Xyl	써모 피셔	8312-4
DER 732C36AA10:C33	전자 현미경 과학	13010
포도당	시그마 알드리치	G7528 (영문
다이아몬드 나이프	디아토메	히스토; 울트라 450
DMAE	전자 현미경 과학	13300
전자 현미경	일본 전자(JEOL)	JEOL-1400 플래시
ERL 4221	전자 현미경 과학	15004
에탄올 100%	피셔 화학 물질	A405P
글루타르알데히드 3%	전자 현미경 과학	16538-15
글리신	알파 에자르	A13816 (영문
염산	피셔 사이언티픽	SA56
마이크로 몰드	테드 펠라	10505
마이크로톰	라이카 마이크로시스템	엠 UC7
노멀 염소 세럼	인비트로젠	PCN5000
미국 국가안보국(NSA	전자 현미경 과학	19050
오스뮴 테트록사이드	전자 현미경 과학	19150
파라필름	제네세 사이언티픽	16-101
염화칼륨	시그마 알드리치	P5655
인산칼륨 monobasic	시그마 알드리치	71640
Qdot 655 Streptavidin 접합체	인비트로젠	Q10121MP
나트륨 아세테이트	피셔 사이언티픽	BP334
소듐 카코딜레이트	전자 현미경 과학	12,300
소금	피셔 사이언티픽	BP358
메타기간산나트륨	시그마 알드리치	71859
인산나트륨 이염기성	시그마 알드리치	P9541
수술용 칼날(사이즈 10)	아스펜 외과	371110
TEM 이미지 소프트웨어	AMT-V700	AMT TEM 이미징 시스템
TEM 이미징 카메라	XR80 TEM 시리즈	AMT TEM 이미징 시스템
톨루이딘 블루 O 용액 (0.5%)	피셔 사이언틱	S25612
우라닐 아세테이트	폴리사이언스	21447