방법 논문

신장의 3차원 이미징을 위한 전체 마운트 장기 염색 기술

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

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출처: Hasegawa, S., et al. CUBIC을 사용한 전체 신장 3차원 염색. J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오는 CUBIC(clear, unstructed brain/body imaging cocktails and computational analysis)이라는 조직 제거 방법과 면역형광 염색을 사용하여 쥐 신장의 전체 마운트 염색에 대한 분석을 보여줍니다. 신장은 조직 투명화를 거쳐 신장을 탈지화, 탈색 및 굴절률 정합 용액으로 처리하여 최적의 3차원 이미징을 위해 조직을 투명하게 만듭니다. 조직은 형광 표지된 항체로 염색되어 광시트 현미경으로 조직의 교감 신경과 동맥을 드러냅니다.

프로토콜

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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 동물 준비 및 신장 고정

  1. 아래 단계에 따라 관류 고정을 수행합니다.
    1. 이소플루란(3%, 2.0L/분)을 흡입하고 메데토미딘 염산염(0.3mg/kg), 부토르파놀 타르타르산염(5mg/kg) 및 미다졸람(4mg/kg)을 복강내 투여하여 마우스를 마취합니다(재료 표 참조).
    2. 인산염 완충액(PB)에 함유된 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4) 20mL와 4% 파라포름알데히드(PFA) 30mL를 심장의 좌심실을 통해 동물을 관류합니다.
  2. 관류 고정 및 신장 샘플링 직후 침지 고정을 수행합니다.
    1. 신장을 4°C에서 4% PFA에 추가로 16시간 동안 담근 다음 PBS로 2시간(3회) 동안 세척합니다9(그림 1).
      주의: 포름알데히드와 파라포름알데히드는 독성 자극제입니다. 흄 후드의 시약을 적절한 개인 보호 장비와 함께 취급하십시오.

2. 탈색 및 탈색

  1. 이전에 발표된 보고서에 따라 Triton X-100 10 wt%와 N-buthyldiethanolamine 10 wt%로 구성된 탈색 및 탈색을 위한 CUBIC-L(Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)을 준비합니다(재료 표 참조).
  2. 아래 단계에 따라 CUBIC-L에 의한 탈색 및 탈색을 수행합니다.
    1. 14mL 원형 바닥 튜브(재료 표 참조)에 50%(v/v) CUBIC-L(물과 CUBIC-L의 1:1 혼합물) 7mL에 고정 신장을 실온에서 6시간 동안 부드럽게 흔든 후 담그십시오(그림 2A). 그런 다음 14mL 원형 바닥 튜브에 7mL의 CUBIC-L을 넣고 37°C에서 5일 동안 부드럽게 흔듭니다.
    2. 이 과정에서 CUBIC-L을 매일 새로 고칩니다. 탈색 및 탈색 과정 후 PBS로 실온에서 2시간(3회) 동안 신장을 세척합니다(그림 1). 시료 취급을 위해 디스펜싱 스푼을 사용합니다(그림 2B).

3. 전체 마운트 면역 형광 염색

  1. 염색 완충액을 준비합니다.
    1. 0.5%(v/v) Triton X-100, 0.5% PBS 내 카제인 및 0.05% 아지드화나트륨을 혼합하여 1차 항체에 대한 염색 완충액을 준비합니다.
    2. 0.5%(v/v) Triton X-100, 0.1% 카제인 PBS 및 0.05% 아지드화나트륨을 혼합하여 2차 항체에 대한 염색 완충액을 준비합니다.
  2. 1차 항체로 염색을 수행합니다.
    1. 탈립된 신장을 37°C의 염색 완충액에 1차 항체(1:100 또는 1:200, 재료 표 참조)로 7일 동안 부드럽게 흔들어 면역염색합니다.
      메모: 한쪽 신장에 필요한 염색 완충액의 양은 500-600 μL입니다(그림 2C).
    2. 0.5%(v/v) Triton X-100 in PBS(PBST)를 넣고 실온에서 1일 동안 신장을 세척합니다(그림 1).
  3. 2차 항체로 염색을 수행합니다.
    1. 염색 완충액에 2차 항체(1:100 또는 1:200, 표 참조)를 넣고 37°C에서 7일 동안 부드럽게 흔들어 신장을 면역염색합니다. PBST로 실온에서 1일 동안 신장을 세척합니다(그림 1).
    2. 고정 후 PB(37% 포름알데히드와 PB의 1:36 혼합물)에 1% 포름알데히드에 신장을 3시간 동안 담그고 PBS로 실온에서 6시간 동안 세척합니다(그림 1).

4. 굴절률(RI) 정합

  1. CUBIC-R+를 준비합니다.
    1. 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine 45 wt%와 니코틴아미드 30 wt%를 혼합하여 CUBIC-R을 제조합니다(재료 표 참조).
    2. 이전에 발표된 보고서에 따라 CUBIC-R에 0.5 v%의 N-부틸디에탄올아민을 첨가하여 굴절률(RI) 일치를 위한 CUBIC-R+를 준비합니다.
  2. RI 일치를 수행합니다.
    1. 14mL의 둥근 바닥 튜브에 50%(v/v) CUBIC-R+(물과 CUBIC-R+의 1:1 혼합물)가 함유된 7mL에 신장을 실온에서 1일 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 그런 다음 14mL 원형 바닥 튜브에 7mL의 CUBIC-R+를 넣고 실온에서 2일 동안 부드럽게 흔든 상태로 담급니다(그림 1).
      메모: RI 매칭이 시작될 때 신장은 50% CUBIC-R+에서 떠오르지만, 과정이 끝나면 CUBIC-R+로 가라앉고 투명해집니다(그림 2D).

5. 이미지 획득 및 재구성

  1. 이미지 획득(RI = 1.51) 중에 RI 일치 신장을 실리콘 오일(RI = 1.555)과 미네랄 오일(RI = 1.467)(55:45)의 혼합물에 담그십시오(그림 3).
  2. 맞춤형으로 제작된 광시트 형광 현미경으로 전체 신장의 3D 이미지를 획득합니다(재료 표 참조). 모든 원시 이미지 데이터를 16비트 TIFF 형식으로 수집합니다. 이미징 분석 소프트웨어(Imaris, 재료 표 참조)를 사용하여 3D 렌더링 이미지를 시각화하고 캡처합니다.

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결과

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figure-results-1
그림 1: 조직 투명화 및 전체 마운트 면역형광 염색. CUBIC에 의한 조직 투명화는 탈lipidation(CUBIC-L) 및 굴절률(RI) 매칭(CUBIC-R+)의 2단계 프로세스입니다. 전체 마운트 염색은 탈lipidation 공정 후에 수행됩니다. 스케일 바 = 10mm. 이미지는 Hasegawa et al.에서 복제되었습니다.

figure-results-2
그림 2: 처리 프로세스의 이미지. (A) 샘플을 14mL 원형 바닥 튜브에 50% 또는 100%...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
14mL 둥근 바닥 고선명도 PP 시험관송골매352059조직 투명화, 염색, 세척
2,3-디메틸-1-페닐-5-피라졸론/안티피린도쿄 화학 공업D1876큐빅-R+
37% - 포름알데히드 용액나칼라이 테스크16223-55고정 후
4%-파라포름알데히드 인산염 완충 용액나칼라이 테스크제09154-85신장 고정
Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG 항체인비트로젠A-214362차 항체 (1:100)
Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG 항체인비트로젠A-315732차 항체 (1:200)
Anti-aquaporin 2 (AQP2) 항체아브캠AB1999751차 항체 (1:100)
항-podocin 항체시그마-알드리치P03721차 항체 (1:100)
항나트륨 포도당 공동수송체 2 (SGLT2) 항체아브캠AB856261차 항체 (1:100)
anti-tyrosine hydroxylase (TH) 항체아브캠AB1131차 항체 (1:100)
안티α평활근액틴(α-SMA) 항체아브캠ab56941차 항체 (1:200)
PBS의 차단제 카제인써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific37528염색 완충액
부토르파놀 타르타르산메이지5526마 취
C57BL/6NJclNippon Bio-Supp.Center해당 사항 없음마우스 변형
이마리스비트플레인해당 사항 없음이미징 분석 소프트웨어
매크로 줌 현미경올림푸스MVX10맞춤형 현미경의 관찰 장치
메데토미딘 염산염쿄리츠세이야쿠8656마 취
미다졸람산도즈27803229마 취
미네랄 오일시그마-알드리치M8410이멀젼 오일
N-부틸디에탄올아민도쿄 화학 공업B0725입방-L, 입방-R+
니코틴아미드도쿄 화학 공업N0078큐빅-R+
폴리에틸렌 글리콜 모노-p-이소옥틸페닐 에테르/트리톤 X-100나칼라이 테스크12967-45입방-L, PBST
실리콘 오일 HIVAC-F4신에츠케미칼50449832이멀젼 오일
아지드화나트륨와코Tel.: 195-11092염색 완충액
년 호 (영문) ) 년 시리즈 년 【무수정유출】 년

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