신장의 3차원 이미징을 위한 전체 마운트 장기 염색 기술

초록

출처: Hasegawa, S., et al. CUBIC을 사용한 전체 신장 3차원 염색. J. Vis. 특급 (2022).

이 비디오는 CUBIC(clear, unstructed brain/body imaging cocktails and computational analysis)이라는 조직 제거 방법과 면역형광 염색을 사용하여 쥐 신장의 전체 마운트 염색에 대한 분석을 보여줍니다. 신장은 조직 투명화를 거쳐 신장을 탈지화, 탈색 및 굴절률 정합 용액으로 처리하여 최적의 3차원 이미징을 위해 조직을 투명하게 만듭니다. 조직은 형광 표지된 항체로 염색되어 광시트 현미경으로 조직의 교감 신경과 동맥을 드러냅니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 동물 준비 및 신장 고정

1. 아래 단계에 따라 관류 고정을 수행합니다.
   1. 이소플루란(3%, 2.0L/분)을 흡입하고 메데토미딘 염산염(0.3mg/kg), 부토르파놀 타르타르산염(5mg/kg) 및 미다졸람(4mg/kg)을 복강내 투여하여 마우스를 마취합니다(재료 표 참조).
   2. 인산염 완충액(PB)에 함유된 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4) 20mL와 4% 파라포름알데히드(PFA) 30mL를 심장의 좌심실을 통해 동물을 관류합니다.
2. 관류 고정 및 신장 샘플링 직후 침지 고정을 수행합니다.
   1. 신장을 4°C에서 4% PFA에 추가로 16시간 동안 담근 다음 PBS로 2시간(3회) 동안 세척합니다9(그림 1).
      주의: 포름알데히드와 파라포름알데히드는 독성 자극제입니다. 흄 후드의 시약을 적절한 개인 보호 장비와 함께 취급하십시오.

2. 탈색 및 탈색

1. 이전에 발표된 보고서에 따라 Triton X-100 10 wt%와 N-buthyldiethanolamine 10 wt%로 구성된 탈색 및 탈색을 위한 CUBIC-L(Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)을 준비합니다(재료 표 참조).
2. 아래 단계에 따라 CUBIC-L에 의한 탈색 및 탈색을 수행합니다.
   1. 14mL 원형 바닥 튜브(재료 표 참조)에 50%(v/v) CUBIC-L(물과 CUBIC-L의 1:1 혼합물) 7mL에 고정 신장을 실온에서 6시간 동안 부드럽게 흔든 후 담그십시오(그림 2A). 그런 다음 14mL 원형 바닥 튜브에 7mL의 CUBIC-L을 넣고 37°C에서 5일 동안 부드럽게 흔듭니다.
   2. 이 과정에서 CUBIC-L을 매일 새로 고칩니다. 탈색 및 탈색 과정 후 PBS로 실온에서 2시간(3회) 동안 신장을 세척합니다(그림 1). 시료 취급을 위해 디스펜싱 스푼을 사용합니다(그림 2B).

3. 전체 마운트 면역 형광 염색

1. 염색 완충액을 준비합니다.
   1. 0.5%(v/v) Triton X-100, 0.5% PBS 내 카제인 및 0.05% 아지드화나트륨을 혼합하여 1차 항체에 대한 염색 완충액을 준비합니다.
   2. 0.5%(v/v) Triton X-100, 0.1% 카제인 PBS 및 0.05% 아지드화나트륨을 혼합하여 2차 항체에 대한 염색 완충액을 준비합니다.
2. 1차 항체로 염색을 수행합니다.
   1. 탈립된 신장을 37°C의 염색 완충액에 1차 항체(1:100 또는 1:200, 재료 표 참조)로 7일 동안 부드럽게 흔들어 면역염색합니다.
      메모: 한쪽 신장에 필요한 염색 완충액의 양은 500-600 μL입니다(그림 2C).
   2. 0.5%(v/v) Triton X-100 in PBS(PBST)를 넣고 실온에서 1일 동안 신장을 세척합니다(그림 1).
3. 2차 항체로 염색을 수행합니다.
   1. 염색 완충액에 2차 항체(1:100 또는 1:200, 표 참조)를 넣고 37°C에서 7일 동안 부드럽게 흔들어 신장을 면역염색합니다. PBST로 실온에서 1일 동안 신장을 세척합니다(그림 1).
   2. 고정 후 PB(37% 포름알데히드와 PB의 1:36 혼합물)에 1% 포름알데히드에 신장을 3시간 동안 담그고 PBS로 실온에서 6시간 동안 세척합니다(그림 1).

4. 굴절률(RI) 정합

1. CUBIC-R+를 준비합니다.
   1. 2,3-dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone/antipyrine 45 wt%와 니코틴아미드 30 wt%를 혼합하여 CUBIC-R을 제조합니다(재료 표 참조).
   2. 이전에 발표된 보고서에 따라 CUBIC-R에 0.5 v%의 N-부틸디에탄올아민을 첨가하여 굴절률(RI) 일치를 위한 CUBIC-R+를 준비합니다.
2. RI 일치를 수행합니다.
   1. 14mL의 둥근 바닥 튜브에 50%(v/v) CUBIC-R+(물과 CUBIC-R+의 1:1 혼합물)가 함유된 7mL에 신장을 실온에서 1일 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 그런 다음 14mL 원형 바닥 튜브에 7mL의 CUBIC-R+를 넣고 실온에서 2일 동안 부드럽게 흔든 상태로 담급니다(그림 1).
      메모: RI 매칭이 시작될 때 신장은 50% CUBIC-R+에서 떠오르지만, 과정이 끝나면 CUBIC-R+로 가라앉고 투명해집니다(그림 2D).

5. 이미지 획득 및 재구성

1. 이미지 획득(RI = 1.51) 중에 RI 일치 신장을 실리콘 오일(RI = 1.555)과 미네랄 오일(RI = 1.467)(55:45)의 혼합물에 담그십시오(그림 3).
2. 맞춤형으로 제작된 광시트 형광 현미경으로 전체 신장의 3D 이미지를 획득합니다(재료 표 참조). 모든 원시 이미지 데이터를 16비트 TIFF 형식으로 수집합니다. 이미징 분석 소프트웨어(Imaris, 재료 표 참조)를 사용하여 3D 렌더링 이미지를 시각화하고 캡처합니다.

결과

그림 1: 조직 투명화 및 전체 마운트 면역형광 염색. CUBIC에 의한 조직 투명화는 탈lipidation(CUBIC-L) 및 굴절률(RI) 매칭(CUBIC-R+)의 2단계 프로세스입니다. 전체 마운트 염색은 탈lipidation 공정 후에 수행됩니다. 스케일 바 = 10mm. 이미지는 Hasegawa et al.에서 복제되었습니다.

그림 2: 처리 프로세스의 이미지. (A) 샘플을 14mL 원형 바닥 튜브에 50% 또는 100%...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
14mL 둥근 바닥 고선명도 PP 시험관	송골매	352059	조직 투명화, 염색, 세척
2,3-디메틸-1-페닐-5-피라졸론/안티피린	도쿄 화학 공업	D1876	큐빅-R+
37% - 포름알데히드 용액	나칼라이 테스크	16223-55	고정 후
4%-파라포름알데히드 인산염 완충 용액	나칼라이 테스크	제09154-85	신장 고정
Alexa Flour 555-conjugated donkey anti-sheep IgG 항체	인비트로젠	A-21436	2차 항체 (1:100)
Alexa Flour 647-conjugated donkey anti-rabbit IgG 항체	인비트로젠	A-31573	2차 항체 (1:200)
Anti-aquaporin 2 (AQP2) 항체	아브캠	AB199975	1차 항체 (1:100)
항-podocin 항체	시그마-알드리치	P0372	1차 항체 (1:100)
항나트륨 포도당 공동수송체 2 (SGLT2) 항체	아브캠	AB85626	1차 항체 (1:100)
anti-tyrosine hydroxylase (TH) 항체	아브캠	AB113	1차 항체 (1:100)
안티α평활근액틴(α-SMA) 항체	아브캠	ab5694	1차 항체 (1:200)
PBS의 차단제 카제인	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	37528	염색 완충액
부토르파놀 타르타르산	메이지	5526	마 취
C57BL/6NJcl	Nippon Bio-Supp.Center	해당 사항 없음	마우스 변형
이마리스	비트플레인	해당 사항 없음	이미징 분석 소프트웨어
매크로 줌 현미경	올림푸스	MVX10	맞춤형 현미경의 관찰 장치
메데토미딘 염산염	쿄리츠세이야쿠	8656	마 취
미다졸람	산도즈	27803229	마 취
미네랄 오일	시그마-알드리치	M8410	이멀젼 오일
N-부틸디에탄올아민	도쿄 화학 공업	B0725	입방-L, 입방-R+
니코틴아미드	도쿄 화학 공업	N0078	큐빅-R+
폴리에틸렌 글리콜 모노-p-이소옥틸페닐 에테르/트리톤 X-100	나칼라이 테스크	12967-45	입방-L, PBST
실리콘 오일 HIVAC-F4	신에츠케미칼	50449832	이멀젼 오일
아지드화나트륨	와코	Tel.: 195-11092	염색 완충액

년 호 (영문) ) 년 시리즈 년 【무수정유출】 년