피부 생검 절편에서 알파-시누클레인 응집체를 검출하기 위한 면역형광 분석

초록

출처: Vacchi, E., et al. 자유 부동 면역형광 분석에 의한 피부 말초 신경 섬유의 알파 시누클레인 응집체 표적으로 삼기. J. Vis. 특급. (2019).

이 비디오는 피부 생검 절편에서 신경퇴행성 질환 특이적 알파-시누클레인 응집체를 검출하기 위한 면역형광 분석을 보여줍니다. 자유 부유 면역 염색은 피부 뉴런의 카르복실 말단 가수분해효소와 알파-시누클레인 응집체를 형광 라벨링하는 데 사용됩니다. 컨포칼 현미경 하에서, 두 항체로부터 형광을 가진 세포는 진피 뉴런에 알파-시누클레인 응집체가 존재함을 나타냅니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 피부 생검 수집

1. 자격을 갖춘 의사가 적절한 임상 환경에서 피부 생검을 수행하도록 하십시오.
2. 피부 생검을 수행할 부위를 선택하고 알코올 면봉으로 청소합니다.
3. 마취액에 리도카인 1cc 2%를 준비합니다.
4. 바늘을 해당 부위와 평행하게 하여 국소 마취제를 피하에 주입합니다.
5. 마취 효과를 확인한 후 3mm 일회용 펀치를 잡고 회전하고 섬세한 하향 압력을 가하여 표피와 진피를 통해 아래로 회전시켜 피하 지방에 도달 할 때까지
회전시킵니다.
6. 펀치를 빼냅니다.
7. 일회용 집게를 사용하여 피부 플러그를 부드럽게 위로 당깁니다.
8. 가위를 사용하여 지방 조직 수준에서 표본의 바닥을 잘라냅니다.
9. 10mL의 PLP(periodate-lysine-paraformaldehyde) 고정 용액이 들어 있는 튜브에 검체를 넣습니다.
10. 해당 부위를 소독하고 접착 붕대로 덮으십시오.

2. 조직 고정 및 저장

1. 새로운 PLP 정착액을 만듭니다(표 1 참조).
2. 피부 생검 채취 직후, 10mL의 PLP 고정 용액이 들어있는 튜브에 담그고 4 °C에서 하룻밤 (O / N) 배양합니다.
3. 다음 날, 흄 후드 아래에서 PLP 고정제를 부드럽게 제거하고 동일한 튜브에서 0.1M Sorensen 용액 5mL로 생검을 5분 동안 3회 세척합니다(표 1).
4. Sorensen 용액을 버리고 4°C에서 5mL의 동결 보호 용액 O/N으로 생검을 배양합니다.
5. cryotome을 사용한 절단이 1주일 이내에 수행된 경우 생검을 4°C에서 보관하고, 절단이 3개월 이내에 수행된 경우 -20°C에서 생검을 보관하고, 생검을 cryomold(단계 3.2-3.4)에 삽입하고 -80°C에서 보관하여 더 오랜 기간 동안 보존합니다.

3. 크라이오톰으로 자른 조직

1. 극저온체를 -20°C로 설정합니다.
2. cryomold를 사용하여 cryo-embedding 매체로 채웁니다. 거품을 만들지 마십시오.
3. 핀셋을 사용하여 종축(표피 - 진피)이 cryomold의 바닥과 평행하도록 하여 생검을 cryo-embedding 매체에 담그십시오.
4. 액체 질소로 시료를 스냅 동결하여 올바른 방향으로 생검을 포함하는 극저온 매립 매체의 고체 큐브를 얻습니다.
5. 검체를 저온 유지 장치에 넣고 생검이 순응할 때까지 30분 동안 기다립니다.
6. 샘플을 저온 유지 장치에 고정하고 50μm 절편을 자릅니다.
7. 약간의 브러시를 사용하여 각 웰에 200μL의 부동액이 들어 있는 96웰 플레이트에 극저온 절편을 옮깁니다. 우물당 하나의 섹션.
8. -20 °C에서 보관하십시오.
   메모: 전체 생검 분석이 분석되지 않은 경우 부분적으로만 절단합니다. 이 경우, 절편은 -20°C에서 보관하고 생검의 나머지 부분은 -80°C에서 보관하여 더 오랜 기간 동안 보존해야 합니다.

4. 면역형광 염색

1. 96웰 플레이트에 100μL의 세척 용액을 채웁니다.
2. 분석할 섹션을 보관 플레이트에서 세척 용액이 들어 있는 새 플레이트로 옮깁니다.각 웰당 1개의 섹션(해부학적 부위당 4개의 섹션, 환자당: 일반적으로 환자당 총 12개의 섹션).
3. 세척액에 넣은 부분을 실온(RT)에서 10분 동안 그대로 두십시오. 동일한 용액이 들어 있는 다른 우물로 섹션을 옮기고 세척을 반복합니다.
4. 100μL의 차단 용액이 포함된 새 웰로 절편을 옮기고 최소 90분 동안 그리고 RT에서 최대 4시간 동안 배양합니다.
5. 작업 용액에서 1차 항체 anti-PGP9.5(Rabbit polyclonal, 1:1000) 및 anti-5G4(Mouse monoclonal, 1:400)를 희석합니다.
6. 100 μL의 1차 항체 작업 용액을 포함하는 새로운 웰로 절편을 옮기고 RT에서 O/N을 배양합니다.
7. 4.3 단계로, 100 μL의 세척 용액으로 RT에서 최소 10 분 동안 섹션을 2 회 세척합니다.
8. 2차 항체(다른 형광단과 접합체) Goat anti-Rabbit을 희석하여 PGP9.5(1:700)를 검출하고 Goat anti-Mouse를 희석하여 작업 용액에서 5G4(1:700)를 검출합니다.
9. RT에서 90분 동안 2차 항체의 작업 용액 100μL를 포함하는 새 웰로 절편을 옮깁니다. 이 시점부터 96웰 플레이트를 알루미늄 호일로 덮어 2차 항체와 결합된 형광단의 표백을 방지합니다.
10. 4.3 단계로 세척 용액 100 μL로 섹션을 최소 10 분 동안 2 회 세척합니다.
11. RT에서 5분 동안 100μL의 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI, 인산염 완충 식염수[PBS] 1x에 1:5,000 희석)을 포함하는 새 웰로 절편을 옮깁니다.
12. 4.3 단계로 세척 용액 100 μL로 섹션을 최소 10 분 동안 2 회 세척합니다.
13. 잘못 접히지 않도록 슬라이드의 섹션을 올바른 위치에 장착하십시오.
14. 슬라이드에 장착 매체를 몇 방울 떨어뜨리고 커버슬립으로 덮습니다.
15. 컨포칼/형광 현미경을 사용하기 전에 슬라이드를 O/N으로 건조시키십시오.
16. 슬라이드는 빛 노출을 피하면서 4°C의 적절한 상자에 보관하십시오. 정확하게 저장되면 약 6개월 동안 신호를 볼 수 있습니다.
    메모: 새로 절단된 절편을 포함하는 96웰 플레이트에서 세척 용액을 포함하는 96웰 플레이트로 단면을 옮기는 작업(단계 4.1)은 생검을 선택하는 데 도움이 되는 작은 브러시를 사용하여 수행됩니다. 섹션을 첫 번째 웰로 옮긴 후 슬라이스를 다른 용액으로 배양해야 할 때마다 브러시를 사용하여 웰에서 웰로 이동합니다.

5. 면역형광 이미징

1. 도립 형광 현미경 또는 컨포칼 현미경으로 단면을 볼 수 있습니다(20X, 40x 또는 그 이상의 배율, 최상의 결과를 위해 Z-스택 플랜에서 2μm 단위의 연속 프레임 사용).
2. 현미경 연결 카메라로 이미지 획득
3. 적절한 이미징 소프트웨어(예: ImageJ)를 사용하여 신호의 공간 분포 및 강도 측면에서 섹션의 포지티브 신호를 분석합니다. 이렇게 하려면 아래에 언급된 단계를 수행하십시오.
   1. ImageJ 소프트웨어로 파일을 엽니다.
   2. 이미지 > 색상 > 분할 채널을 클릭하여 각 색상 채널을 분석합니다.
   3. 이미지를 클릭하여 Z 프로젝트를 스택> > 여러 섹션 획득을 병합합니다.
   4. 이미지를 클릭하여 색상을 >> 채널을 병합하여 동일한 획득의 다른 색상 채널을 병합합니다.

표 1: 필요한 솔루션. 프로토콜에 필요한 솔루션 목록과 준비 방법에 대한 간략한 설명.

부동액 용액 (4°C에서 최대 6개월 보관)	30% 글리세롤 30% 에틸렌 글리콜 30% dH2O 10% 2x 인산염 완충액
차단 솔루션 (지금 준비)	4% 일반 염소 혈청 1% 트리톤 X-100 세척 용액에서
극저온 보호제 (4°C에서 최대 6개월 보관)	20% 글리세롤 80% Sorensen의 솔루션
인산수소수소나트륨 용액 (RT에서 최대 6개월 보관)	0.45M 인산수소 나트륨 (Na2HPO4) dH2O 멸균 병에 담긴 필터
라이신 용액 (4 °C에서 최대 3 주 동안 보관)	0.3M L-라이신 모노하이드로클로라이드 용액 50% 0.1M 소렌센 용액의 50% pH 7.6 pH 7.4, 멸균 병의 필터
파라포름알데히드(PFA) 8% (흄 후드 아래에서 준비하고 최대 1 개월 동안 4 °C에서 보관)	dH2O (55°까지C_do 포름산 형성을 피하기 위해 60 °C를 초과하지 않음)의 2.6M PFA 멸균 병의 필터
인산염 완충액 2x (4°C에서 최대 6개월 보관)	6 % 인산 나트륨 (NaH2PO4) 용액 dH2O의 45 % 인산 나트륨 (Na2HPO4 ) 용액
PLP 정착 용액 (지금 준비하세요, 흄 후드 아래)	25% 파라포름알데히드 8% 0.01M 나트륨 (메타) 간헐 레이트 75% 라이신 용액
나트륨 이수소 인산염 일수화물 (RT에서 최대 6개월 보관)	0.52M 나트륨 인산이 수소 일 수화물 (NaH2PO4 * H2O) dH2O 멸균 병에 필터를 넣습니다.
Sorensen의 솔루션 (4°C에서 최대 1개월 보관)	2.5% 인산나트륨 용액 18.7 % 인산이 나트륨 용액 pH 7.6, dH2O
세척액 (지금 준비)	0.25M 트리즈마 베이스 0.26M NaCl pH 7.6, dH2O
작업 솔루션 (지금 준비)	50% 블로킹 솔루션 50% 세척액

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
5G4(안티 휴먼 αSyneclein 5G4)	Analytik 예나 로보스크린	847-0102004001	마우스 단클론 바이러스
AlexaFluor 488 염소 안티 토끼 IgG	인비트로젠	1971418	2mg/ml
AlexaFluor 594 염소 안티 마우스 IgG	인비트로젠	1922849	2mg/ml
인산수소이나트륨 용액	머크 밀리포어	106586
에틸렌 글리콜	시그마-알드리치	324558
글리세롤	시그마-알드리치	G7757
L-라이신 모노하이드로클로라이드	시그마-알드리치	L5626
파라포름알데히드	알드리치 화학	441244
PGP9.5	아브캠	AB15503	토끼 다클론
소금	시그마	S3014
나트륨 Dihydrogen 인산염 Monohydrate	머크 밀리포어	106346
나트륨 (메타)주기산	시그마-알드리치	S1878
트리즈마 베이스	시그마	T1503
트라이튼 X-100	시그마-알드리치	엑스100
벡타쉴드	벡터 연구소	H-1000	장착 매체

성 년 시리즈