쥐 장 염증을 평가하기 위한 형광 매개 단층 촬영(Fluorescence-Mediated Tomography) 사용

초록

출처: Nowacki, T. M., et al. 대식세포 관련 쥐 장 염증의 검출 및 정량화를 위한 형광 매개 단층 촬영. J. Vis. 특급. (2017년)

이 동영상은 형광 매개 단층촬영(FMT)을 사용하여 쥐 대장염 모델에서 장 대식세포 침투를 평가하는 기술을 보여줍니다. 덱스트란 황산나트륨(DSS)을 통해 마우스에 대장염을 유발하면 대장에 침투한 대식세포의 F4/80 당단백질 마커를 인식하는 항체를 동물에게 주입합니다. 그런 다음 FMT 장치에서 마우스를 이미지화하여 형광 및 반사 신호를 3차원 이미지로 재구성하여 형광의 공간 분포와 강도를 결정합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 머티리얼 및 실험 셋업

1. 동물 관리.
   1. 체중 20-25g에서 DSS에 취약한 균주(예: C57BL/6)의 성별 및 연령이 일치하는 마우스를 사용합니다.
   2. 실험 그룹당 최소 5마리 이상의 생쥐를 계획하고 지역 동물 관리 지침에 따라 생쥐를 수용합니다.
   3. 표준 설치류 차우 식단과 오토클레이브 식수를 자유롭게 제공하십시오.
   4. 표준 차우를 제거하고 스캔 최소 3일 전에 알팔파가 없는 차우로 교체하여 내강 자동 형광을 줄입니다.
2. 급성 DSS 유발 대장염의 유도.
   1. 2g의 DSS(분자량 ~40,000Da)를 오토클레이브 음용수 100mL에 용해시켜 2%(w/v 용액)를 얻습니다.
   2. 마우스의 음용 공급을 DSS 용액으로만 채우고 하루에 마우스당 5mL의 액체를 추정합니다. 대조군 마우스에 DSS가 없는 동일한 식수를 제공합니다.
      메모: 실험이 끝날 때까지 매일 마우스를 모니터링합니다. 초기 체중의 20% 이상을 감량하거나 빈사 상태가 된 생쥐(즉, 지속적으로 구부정한 자세, 움직임 감소, 호흡 곤란, 현저하게 직립한 털)를 동물 복지에 대한 현지 적용 지침에 따라 안락사시킵니다.
3. 형광 매개 단층 촬영의 준비.
   1. 제조업체의 프로토콜에 설명된 대로 원하는 항체(예: rat anti-mouse F4/80)를 형광 염료(예: Cyanine7, λ_excitation: 750 nm, λ_emission: 776 nm)로 라벨링합니다. 정제된 항체를 적절한 투석막(공극 크기 < 50-100kDa)에서 0.15M 염화나트륨 1L에 대해 최소 2시간 또는 하룻밤 동안 투석합니다.
      1. 항체를 0.1M NaHCO3 1L로 옮기고 최소 2시간 동안 투석합니다.
      2. 디메틸설폭사이드(DMSO)(항체 10.8μL/mg)에 필요한 양의 형광 염료를 용해시켜 항체 용액에 첨가합니다. 형광 염료를 20배 몰 초과량에 사용하여 1:3의 염료 대 단백질 비율을 달성합니다.
      3. 4°C의 어두운 곳에서 1시간 동안 배양합니다. 0.15M 나트륨 1L에 대해 투석하거나 PD-10 탈염 컬럼을 사용하여 표지되지 않은 항체를 제거하고 in vivo 적용을 위해 인산염 완충 식염수(PBS)에서 분해합니다.
      4. 분광 광도계로 최종 항체 농도와 표지 비율을 결정합니다.
      5. 250-330 nm의 흡수에서 단백질 농도를 측정하고 염료에 의한 추가 흡수를 고려하십시오. 시아닌 라벨링을 위해 280nm(단백질)에서의 최대 흡수율을 750nm에서의 최대 흡수량(다음 단계)의 11%로 수정합니다.
      6. 250-800 nm에서 화합물의 희석(일반적으로 1:10)을 측정하고 750 nm에서 Cyanine7의 농도를 추출합니다.
      7. 염료/항체 = 750 nm에서 최대 흡수 / 200,000 / (280 nm에서 최대 흡수 - 0.11 x 750 nm에서 최대 흡수) / 170,000으로 염료 대 단백질 비율을 측정합니다.
      8. 항체 용액을 4 °C로 유지하고 주사 전에 표백을 방지하기 위해 빛으로부터 보호하십시오.
   2. 주입 직전에 멸균 주사기에 필요한 항체 용액 부피를 장전하고 사용할 때까지 빛으로부터 보호합니다.
   3. 프로브 주입의 최적 타이밍과 스캐닝 절차는 추적자 약동학에 따라 결정됩니다.
   4. 산소에서 1.5 - 2.5% 흡입된 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취하거나 표지된 항체의 꼬리 정맥 주입을 위한 전용 구속기에 안전하게 놓습니다.
   5. 전장 항체의 경우, 쥐 대장염에서 항마우스 F4/80 대식세포 시각화를 위해 스캔하기 최소 24시간 전에 라벨링된 항체를 주입합니다. 꼬리 정맥을 통해 마우스에 2.0 nmol의 염료에 해당하는 양으로 표지된 항체를 정맥 주사(i.v.
   )합니다.
   6. 동일하게 표지된 비특이적 항체(예: 쥐 IgG 또는 1차 항체 유산에 해당하는 다른 동형)를 특정 프로브와 동일한 용량의 동형으로 사용합니다.
      메모: 대조군 화합물 주입 후 생체 내 스캔 결과는 특정 프로브 이미징 데이터의 해석을 위한 참조 역할을 할 수 있습니다.
   7. 전기 면도기를 사용하여 복부의 동물 털을 면도하여 빛의 반사와 흡수를 최소화하십시오.

2. 기술 장비

1. 소동물 형광을 위해 수의학 형광 매개 단층촬영(FMT) 장치를 사용합니다(그림 1).
2. "new study(새 연구)" 버튼을 클릭하여 각 프로젝트에 대한 새 연구를 생성하고 나중에 참조할 수 있도록 이미징 매개변수 및 선량을 포함한 관련 추적자를 연구 설명에 포함시킵니다.
3. 이 연구 내에서 "새 연구 그룹" 버튼을 클릭하여 각 연구 설계(예: 특정 추적자 및 불특정 isotype 대조군)에 따라 연구 그룹을 만듭니다. 각 연구 그룹에 각각의 동물 수를 갖추십시오.
4. 트레이서 구문에 대해 시스템을 보정합니다.
   1. 트레이서의 각 배치에 대해 보정을 수행하여 라벨링의 변동을 정규화하고 OI 데이터에서 정량적 측정을 가능하게 합니다.
   2. 각 개별 시스템의 교정에 대한 기기 제조업체의 지침을 따르십시오. "새 트레이서 추가"를 선택하면 시스템이 단계를 안내해 줍니다. 적용된 항체 용액의 희석액과 프로브에서 추적자의 계산된 절대 농도를 제공합니다.
   3. FMT의 경우, 정의된 두께와 흡수 특성(생체 조직과 유사)의 조직 모방 팬텀을 사용하고 사용된 항체 용액의 특정 부피로 채웁니다. FMT 장치에서 이를 측정합니다.
      메모: 이 시스템은 제공된 프로브의 기준 측정값을 지정된 농도와 함께 사용하여 향후 생체 내 측정에서 절대 추적 농도를 계산합니다.
5. 온도가 42°C인 가열 가능한 검사 카세트를 사용하십시오.
   메모: 이것은 쥐가 검사 중에 저체온증에 빠지는 것을 방지합니다.

3. 동물 마취

1. 1.5 - 2% vol% isoflurane([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) 및 1.5 L O₂/min의 연속 흐름을 사용하여 마우스를 마취합니다. 설치류 마취를 위해 특별히 설계된 흡입 시스템(이소플루란 기화기)을 사용하여 마취 깊이를 쉽게 제어하고 직원 노출을 최소화합니다.
2. 마우스를 누출 방지 유도 챔버에 놓고 이소플루란 공급을 위해 기화기를 켭니다(100%(v/v), 산소 5vol%, 3L/min). 마우스가 누워서 의식을 잃을 때까지 모니터링합니다.
3. 단층 촬영을 위해 검사 카세트에 넣고 100% v/v, 1.5vol%의 산소 투여량, 1.5L/min의 용량으로 노즈콘을 통해 지속적인 이소플루란 흡입하여 검사 중 움직임 아티팩트를 최소화합니다. 5분 이상 지속되는 절차의 경우 각막 손상을 방지하기 위해 마우스 눈에 안연고를 바르십시오.
4. 반사를 확인하여 마취 깊이를 평가합니다. 마우스를 등에 눕히십시오. 마취가 충분하면 마우스가 돌아서는 안 됩니다. 발가락 사이를 마우스로 부드럽게 꼬집습니다. 마취가 충분하면 다리가 철회되지 않습니다 (외과적 내성 단계).

4. 형광 매개 단층 촬영 스캔

참고: 필요에 따라 대체 형광 반사 이미징 장치 또는 FMT 시스템에 대해 이 연구에 사용된 FMT 시스템(재료 표 참조)에 특정한 다음 세부 사항을 조정합니다.

1. 마취된 마우스를 검사 카세트에 등을 대고 놓습니다.
2. 스캔 절차를 수행합니다.
   1. 카세트를 이미징 시스템에 삽입하고 즉시 닫아 지속적인 마취를 보장합니다. 이전에 생성한 스터디 그룹에서 적절한 표본을 선택합니다. 드롭다운 메뉴에서 관리 추적 프로그램을 선택하여 추적 프로그램 농도 값이 제대로 계산되었는지 확인합니다.
   2. 스캔 계획을 위해 적절한 파장(Cyanine7의 경우 720nm)에서 형광 반사율 이미지를 획득하고 "이미지 획득" 버튼을 클릭하여 스캔 필드의 윤곽을 그립니다.
   3. 스캔 필드가 형광 반사율 이미지에 오버레이로 나타나는지 확인합니다. 관심 영역(예: 결장 또는 복부)에 맞게 조정하고 공기나 남아 있는 털 영역을 피하십시오. 이미지 대상에 따라 오른쪽 메뉴에서 거친 스캔 필드 해상도에서 중간 스캔 필드 해상도까지 선택하여 스캔 필드 내의 이미지 데이터 포인트 수를 설정합니다.
      메모: 미세한 스캔 필드는 스캔 시간이 훨씬 더 길어지는 대신 더 나은 공간 해상도를 제공할 수 있다는 점을 명심하십시오.
   4. "scan"을 클릭하여 선택한 파장에서 데이터/이미지 수집을 시작합니다.
      메모: 전체 복부의 중간 미세 스캔을 위한 스캔 시간은 약 5분입니다. 이 시간 동안 각 데이터 포인트는 여기 레이저에 의해 개별적으로 조명되고 결과 형광이 기록됩니다.
   5. 스캔이 끝나면 이미징 카세트에서 동물을 제거하고 동물이 완전히 회복할 때까지 기다렸다가 케이지에 다시 넣습니다.
   6. 실험 중 다양한 시점(예: 0일, 5일, 9-10일(실험 종료))에서 필요하다고 판단되는 경우 FMT를 반복하되 체내 항체 축적을 고려하여 배경 형광 신호를 증가시킵니다.

5. 데이터 재구성 및 해석

1. 각 이미징 소프트웨어의 재구성 도구를 사용하여 원시 이미징 데이터로부터 형광 분포의 3D 맵을 생성합니다. 스캔 시 "재구성 대기열에 추가" 기능을 선택하면 스캔이 재구성 도구에 자동으로 추가됩니다.
   1. 그렇지 않으면 해당 연구 및 연구 그룹 아래의 드롭다운 메뉴에서 스캔을 선택하고 스캔을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 "재구성에 추가"를 선택합니다.
2. 추가 분석을 위해 데이터 세트를 분석 소프트웨어에 로드합니다. 상단 표시줄의 드롭다운 메뉴에서 해당 연구를 선택한 다음 오른쪽 메뉴에서 연구 그룹과 개별 동물을 선택합니다. 이 동물에 대해 수행된 모든 스캔이 표시됩니다. 올바른 스캔을 선택하고 "로드"를 클릭하십시오.
   메모: 트레이서 분포의 3D 재구성은 처음에 획득한 형광 반사율 이미지의 오버레이로 왼쪽에 나타납니다. 더 쉽게 분석할 수 있도록 모델을 회전하고 확대할 수 있습니다.
3. 재구성된 3D 맵에서 비특이적 라벨 축적(예: 간 또는 소변 방광)의 초점을 식별하고 표적 조직(예: 장 또는 장)과 구별합니다.
4. 상단 표시줄에서 대상에 가장 적합한 ROI 셰이프를 선택합니다. 분석 소프트웨어에 각각의 측정 도구를 배치하여 표적 조직을 관심 영역(ROI)으로 표시합니다. 이 소프트웨어는 ROI에 대한 형광 강도와 스캔이 보정된 추적자의 (피코)몰 양을 제공합니다.
5. ROI 크기에 대해 정규화된 적절한 ROI에서 염증성 침윤(조직학)과 상관 관계에 있는 질병 활성도 평가에 가장 적합한 등가물로 추적자의 총량을 선택합니다.
   메모: ROI의 다른 특징들은 특정 모델을 대표하는 것으로 적절한 경우 선택될 수 있다.

결과

그림 1. 대식세포의 단층 촬영 시각화는 쥐 대장염에 침투합니다.

FMT 스캔은 대장균 마우스 및 비대장성 대조군에서 murine F4/80에 대해 Cyanine7-conjugated 항체를 투여했습니다(그룹당 n = 5). (A) 막대 그래프: ROI에서 염료의 pmol에서 총 형광 강도를 결정하고 SEM± 표시했습니다. 대표 이미지는 특정 프로브(anti-mouse F4/80)(B) 및 비특이적 대조군(rat IgG)(C)으로 주입된 마우스의 염증성 침투 정도에 해당하는 색상으로 구분된 형광 강도로 표시됩니다. 두 경우 모두, 추가 분석을 위해 동일한 크기...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약
알팔파가 없는 식단	Harlan Laboritories, 매디슨, 미국	2014
Bepanthen 눈 연고	Bayer, 레버쿠젠, 독일	80469764
덱스트란 황산염 나트륨(DSS)	TdB Consulatancy, 웁살라, 스웨덴	DB001
에오신	시그마 - 알드리치, 다이젠호펜, 독일	전자 4382
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)	시그마 - 알드리치, 다이젠호펜, 독일	전자 9884
플로렌 100V/V	Abbott, 비스바덴, 독일	나506
헤마톡실린	시그마 - 알드리치, 다이젠호펜, 독일	HHS32-1L
O.C.T. 티슈 텍 컴파운드	Sakura, Zoeterwonde, 네덜란드	4583	조직학적 분석을 위한 정착제
인산염 완충 식염수, PBS	Lonza, Verviers, 벨기에	4629
염화나트륨 0,9%	Braun, Melsungen, 독일	0411년 5월 12211095일
중탄산나트륨 분말	Sigma Aldrich Deisenhofen, 독일	S5761
표준 식단	Altromin, Lage, 독일	1320
Tissue-Tek 크라이오몰드	Sakura, 라이덴, 네덜란드	4566
Hemoccult (guaiac 종이 테스트)	Beckmann Coulter, 독일	3060
Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 항체	Serotec, 영국 옥스퍼드	MCA497B
비오틴 쥐 안티 마우스 안티 GR-1	BD Pharmingen, 하이델베르크 독일	553125
스트렙타비딘-알렉사546	Molecular Probes, 다름슈타트, 독일	S-11225	여기/방출 최대: 556/573nm
항-CD11b 쥐-항-마우스 항체 TC	Calteg, 벌링게임, 미국	R2b06
정제된 안티-마우스 F4/80 항체	BioLegend, 런던, 영국	123102
다피	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, 독일	D9542
FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse 항체	BD Pharmingen, 하이델베르크, 독일	553104
FACS 버퍼	BD Pharmingen, 하이델베르크, 독일	342003
Cy7 NHS 에스테르	GE Healthcare Europe, 독일 프라이부르크	PA17104
MPO 엘리사	Immundiagnostik AG, 벤스하임, 독일	케이 6631B
Cy5.5 표지 안티-마우스 F4/80 항체	BioLegend, 런던, 영국	123127	readyd to use labeled 항체(대체품)
안티 마우스 F4/80 항원 PerCP-Cyanine5.5	eBioscience, 미국 월섬	Tel.: 45-4801-80	readyd to use labeled 항체(대체품)
DMSO(디메틸설폭사이드)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, 독일	67-68-5
이소플루란	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, 독일	792632
에탄올	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, 독일	64-17-5
소 혈청 알부민(BSA)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, 독일	A4612
트리스 완충 식염수(TBS)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, 독일	SRE0032
설비
FACS Calibur 유세포 분석 시스템	BD Biosciences GmbH, 하이델베르크, 독일
FMT 2000 In Vivo 이미징 시스템	PerkinElmer Inc., 미국 매사추세츠주 월섬	FMT2000
True Quant 3.1 이미징 분석 소프트웨어	PerkinElmer Inc., 미국 매사추세츠주 월섬	에 포함됨 FMT2000
Leica DMLB 형광 현미경	Leica, 35578 Wetzlar, 독일	디엠LB
밴들린 소노펄스 HD 2070	Bandelin, 12207 베를린, 독일	HD 2070	초음파 균질화기
일회용 메스 No 10	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, 독일	Z692395-10개
Metzenbaum 가위 14cm	Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, 가이슬링겐, 독일	22398330
루어락 시린지 5ml	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, 독일	Z248010
주사기 바늘	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, 독일	Z192368
팔콘 튜브 50ml	BD Biosciences, Erembodegem, 벨기에	352070

년 시리즈 년 년 년 년 년 호 호 년