검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. Custom Array Layout 설계 및 제작
- 해당 대립유전자 호출이 있는 펩타이드 염기서열의 스프레드시트를 생성합니다. 배열에는 20개의 행과 30개의 열이 있으며 펩타이드에 대해 최대 20x30=600개의 스폿을 보유할 수 있습니다. 한 명의 특정 공여자로부터 1.5단계에서 기록된 총 펩타이드 수와 우리가 시도한 두 가지 예에 대한 과거 경험을 바탕으로 600 스폿 어레이는 ~2개의 개별 이식 사례에서 생성된 모든 염기서열을 보유할 수 있습니다.
- 배열의 600개 스펩트 형식 내에 펩타이드 세트를 맞추는 가장 효율적인 방법을 합리적으로 계획합니다.
- 둘 이상의 주제가 하나의 전체 배열에 들어갈 수 있는 경우 첫 번째 기증자의 시퀀스 뒤에 빈 행을 삽입하여 30으로 나눌 수 있는 총 행 수(배열의 행에 있는 스폿 수)와 일치시킵니다.
- 첫 번째 염기서열 세트에 대한 마지막 빈 행 바로 다음에 두 번째 이식 사례의 염기서열 내용의 전체 열을 붙여넣습니다.
- 어레이가 채워지고 600개의 스폿을 초과하지 않고 더 이상 케이스를 추가할 수 없을 때까지 이 단계를 반복합니다. 전체 빈 행이 맨 아래에 채워져 남아 있는 경우 빈 행을 "이동"하여 두 기증자 세트 사이에 배치합니다. 케이스 사이에 남아있는이 넓은 공간은 합성 완료 후 멤브레인을 더 쉽게 절단 할 수 있습니다 (2.2 단계에 따라). 아래.
- array layout의 컨텍스트에서 펩타이드 염기서열을 프로그래밍합니다. SPOT synthesizer의 프로그램은 시퀀스의 텍스트 형식(1행, 11개의 펩타이드 시퀀스)을 취하며, 이는 1.1.4단계의 결과 스프레드시트를 간단한 텍스트 문서(대립유전자 이름, aa 위치 등에 대한 추가 열 제외)로 저장하여 직접 얻을 수 있습니다.
- SPOT 합성기를 통해 자동화된 펩타이드 어레이 합성을 실행합니다. 합성의 전체 작업은 Kudithipudi et al.에 자세히 설명되어 있습니다. 두 어레이의 Fmoc 합성에는 ~ 4-5 일이 걸립니다.
2. 개별 이식 수혜자의 시계열에서 antisera를 조사하고 다시 조사합니다.
참고: 600개의 스폿 멤브레인 어레이의 크기는 ~7cm x 13cm입니다. 합성 후, 어레이는 직사광선으로부터 차폐될 때 최소 2년 동안 건조 멤브레인으로 실온에서 보관할 수 있습니다. 반복 사용을 위해 수명을 보존하기 위해 멤브레인을 과도하게 접히지 마십시오.
- 멤브레인 어레이를 에탄올로 재수화하고 Ponceau S로 염색된 펩타이드 스펏을 시각화합니다.
- Li et al.에서 최적화된 단계적 절차에 따라 펩타이드를 운반하는 멤브레인 어레이를 재수화합니다.
- 어레이 멤브레인을 100% 에탄올 20mL에 담그십시오.
- 증류수 20mL를 첨가하여 용액을 50% 에탄올로 희석하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
- 침지 용액을 100% 물 40mL로 3회 변경하고 매번 15분씩 배양합니다.
- 적절하게 작동하는 완충액(예: TBST 20mL(트리스 완충 식염수 0.1%))에서 각각 5분씩 3회 세척합니다.
- 합성 펩타이드를 시각화하기 위한 어레이의 Ponceau S 염색
- 사전 제형화된 Ponceau S 용액 20mL를 수화 어레이에 직접 첨가하고 진탕하면서 ~30초 동안 배양합니다.
- 증류수를 멤브레인 위에 지속적으로 흐르게 하여 배경 Ponceau S 색상의 얼룩을 제거합니다. 이 과정에서 붉은 색의 펩타이드 반점이 보일 수 있습니다.
- 개별 사례에 대해 어레이 섹션 사이를 조심스럽게 잘라 각 기증자에 대한 어레이 부분을 분리합니다. 각 배열의 방향을 표시합니다.
- 사전 블록 배열.
- TBST 완충액에 용해된 20% 무지방 우유 5mL에서 멤브레인을 차단합니다. 이 우유 기반 용액은 Ponceau S 색상의 염색을 더욱 제거합니다. 가장 선명한 펩타이드 이미지를 얻기 위해 우유 버퍼를 여러 번 교체하십시오.
- 기록 보관을 위해 핸드헬드 카메라를 사용하여 어레이의 Ponceau S 이미지 사진을 찍습니다(예: 그림 1).
- 5% 무지방 우유의 멤브레인을 4°C에서 하룻밤 동안 또는 실온에서 흔들면서 2시간 동안 계속 차단합니다.
- 이식 항혈청으로 어레이를 배양합니다.
메모: 프로존(prozone) 또는 훅 효과(Hook effect)로 알려진 현상은 혈청 항체 분석에서 보체 의존적 간섭으로 인해 발생할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 이 문제를 피하기 위해 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 또는 혈청 샘플의 열 비활성화를 사용하여 선택적 혈청 전처리 단계를 고려할 수 있습니다.
- 차단 버퍼를 제거하고 TBST 20mL로 멤브레인을 다음날 3회 5분씩 세척합니다.
- TBST 완충액에 2.5% 우유 20mL에 투여인의 조혈청 20μL를 첨가하고 실온에서 2-3시간 동안 멤브레인과 함께 배양합니다. 이 초기 프로빙 라운드에서는 시계열에서 마지막 이식 후 혈청(또는 가장 민감할 가능성이 있는 혈청)을 먼저 사용하는 것이 좋습니다. 이는 시리즈의 초기 검체, 특히 이식 전 시점의 검체가 시간이 지남에 따라 발생하는 경향이 있는 동종 항체의 다양성이 적다는 가정에 근거합니다. 이러한 방식으로, 프로빙 라운드 사이의 "캐리오버(carry-over)"로 인한 신호 간섭 가능성은 이식편에 대한 면역 반응으로 인해 실제로 개발된 동종 항체 반응과 명확하게 구별될 수 있습니다.
- TBST 20mL를 사용하여 어레이를 세척하고 2차 항체로 배양합니다.
- 매번 10분 동안 멤브레인을 세 번 세척합니다.
- 염소 항-인간 IgG-HRP(양고추냉이 과산화효소) 2차 항체를 1:10,000 희석한 TBST 완충액에 1% 우유로 2시간 더 배양합니다.
- 얼룩을 씻고 개발하십시오.
- 매번 10분 동안 TBST로 멤브레인을 세 번 세척합니다.
- 멤브레인을 개발하기 위해 5mL의 과산화물 용액과 갓 혼합한 5mL의 루미놀 용액을 사용하여 향상된 화학발광(ECL)을 수행합니다(1분 동안).
- 적절한 이미저(예: ChemiDoc Imaging Systems 또는 Azure C600)를 사용하여 ECL 신호를 시각화합니다.
- 블롯을 스캔하고 정량화합니다.
- 현상된 이미지(그림 2, 아래 이미지)를 저장하고 스폿 강도의 정량화를 수행합니다.
3. 임상 시계열 전반에 걸친 항혈청 반응성 비교.
- 배열을 스트립합니다.
- 이 시점에서 멤브레인을 항상 젖은 상태로 유지하십시오.
- 시판되는 스트리핑 버퍼 20mL를 37°C에서 20분 동안 배양하여 멤브레인을 벗긴 다음 TBST로 멤브레인을 각각 10분 동안 3회 세척합니다. 그런 다음 다른 시점에서 채취한 환자의 다른 혈청을 사용하여 차단(3.2단계) 및 프로빙(3.3단계) 단계를 반복합니다.
- 블록이 벗겨진 멤브레인.
참고: 스트리핑 후, 멤브레인은 시계열에서 동일한 환자의 다른 혈청에 대한 또 다른 프로빙에 재사용할 수 있습니다.
- 이전과 같이 5% 우유 완충액을 사용하여 멤브레인을 차단합니다(2.2단계 참조).
- 동일한 시계열에서 다른 항혈청을 다시 프로브합니다(2.3-2.6의 단계 반복, 그림 2, 상단 이미지의 예).
메모: 그런 다음 스트리핑된 어레이를 사용하여 다른 혈청 검체를 다시 프로브할 수 있습니다. 펩타이드는 멤브레인의 지지 매트릭스에 공유 결합되기 때문에 어레이가 성능 저하 없이 최대 20라운드의 스트리핑 및 회수 주기 동안 재사용될 수 있음을 보여주었습니다.
