Printed Glycan Array를 사용한 순환 항글라이칸 항체 검출

초록

출처: Olivera-Ardid, S. et al., Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals(인쇄된 글라이칸 어레이: 작은 동물에서 순환하는 항탄수화물 항체의 레퍼토리 분석을 위한 민감한 기술).J. Vis. 특급(2019년)

이 동영상은 마우스 혈청에서 순환하는 항글라이칸 항체를 분석하기 위한 인쇄된 글라이칸 어레이 기술을 보여줍니다. 혈청의 항체는 칩의 특정 글라이칸과 상호 작용하며, 이는 면역 염색 후 형광 스캔으로 확인됩니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 글리코칩 생산

1. 마이크로어레이 준비
   1. 비접촉 로봇 어레이어(방울 부피 ~900 pL)를 사용하여 300 mM 인산염 완충 식염수(PBS, pH 8.5)의 글라이칸(50 mM) 및 다당류(pH 8.5)를 N-하이드록시숙신이미드 유도체화된 유리 슬라이드에 6회 복제하여 인쇄합니다. 각 슬라이드에는 6번 반복되는 4개의 서로 다른 하위 어레이 블록(그림 1A, 색상)이 포함되어 있습니다. 모든 단일 서브 어레이는 대조군(8개 행 × 14개 열)을 포함하여 112개의 서로 다른 글라이칸 스폿으로 형성됩니다(그림 1B).
      메모: 글리칸 관련 정보는 표 1에 나와 있습니다. 마이크로칩 인쇄에 사용되는 글라이칸 라이브러리는 IBCh 팀의 장기적인 합성 노력의 결과입니다. 합성의 예는 관련 출판물에 설명되어 있습니다. 글라이칸 라이브러리에는 혈액형 항원과 가장 빈번하게 발생하는 말단 올리고당뿐만 아니라 포유류의 N 및 O 결합 당단백질 및 당지질, 종양 관련 탄수화물 항원 및 병원성 박테리아의 다당류의 핵심 모티프가 포함되었습니다.
   2. 슬라이드를 수분 상자(상대 습도 ~70%)에 넣고 실온(25°C)에서 1시간 동안 배양합니다.
   3. 블로킹 마이크로어레이: 실온(100mM 붕산, 25mM 에탄올아민, 초순수 중 0.2%(v/v) Tween-20)에서 블로킹 버퍼를 사용하여 1.5시간 동안 슬라이드를 배양합니다.
   4. 글리코칩을 초순수로 씻고 공기로 건조시킵니다.
2. Glycochip 품질 관리
   1. 복합 면역글로불린 제제(CIP, 면역글로불린 함유: IgG, IgM 및 IgA)의 1mg/mL 용액, 2차 항체(IgM + IgG + IgA)인 비오틴화된 염소 항인간 면역글로불린 10μg/mL 용액, 해당 형광 스트렙타비딘 접합체의 1μg/mL 용액(아래 설명된 프로토콜을 통해, 2단계 참조)을 사용하여 각 배치에서 두 개의 마이크로어레이를 분석합니다.
   2. 글리코칩을 스캔하고 분석합니다(3단계, 글라이칸 어레이 분석 참조).
   3. 칩 내부 및 칩 간 상관관계가 0.9보다 높은 마이크로어레이 배치를 사용합니다.

2. 글라이칸 어레이 기술

1. 다음 수용액(초순수)을 준비하고 실온(25°C)에서 보관하십시오.
   1. 완충액-1: 인산염 완충 식염수(PBS) 내 1%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA), 1%(v/v) Tween-20 및 0.01%(w/v) 아지드화나트륨(NaN₃).
   2. 버퍼-2: PBS에서 1%(w/v) BSA, 0.1%(v/v) Tween-20 및 0.01%(w/v) NaN₃.
   3. 버퍼-3: PBS에서 0.1%(v/v) Tween-20.
   4. 버퍼-4: PBS에서 0.001%(v/v) Tween-20.
2. 글리코칩 및 시료 준비
   1. 슬라이드가 있는 보관 상자를 실온(25°C)에 도달할 때까지 테이블 위에 놓습니다.
      메모: 가루가 없는 라텍스 장갑을 사용하십시오. 글리코칩은 바코드가 있는 유리 슬라이드의 하단 부분으로 조작해야 합니다. 바코드는 글라이칸이 인쇄되는 표면과의 접촉을 피하여 오른쪽을 식별하는 데 도움이 됩니다.
   2. 상자를 열고 글리코칩을 꺼내 챔버 내부의 습도를 일정하게 유지하기 위해 이미 젖은 여과지로 조절된 배양 챔버(25°C)에 넣습니다.
   3. 한편, Buffer-1 (1:20)이 함유된 마우스 혈청을 1.5 mL 튜브에 희석합니다. 세럼 용액(5초)을 와류 믹서로 균질화합니다.
      메모: 단일 글리코칩 표면을 완전히 덮는 데 필요한 부피는 약 1mL입니다.
   4. 균질화 후, 면역글로불린 응집을 피하기 위해 37°C의 수조에서 10분 동안 희석된 혈청을 배양합니다. 10,000 x g 및 25 °C에서 3분 동안 튜브를 원심분리하고 상층액을 수집하고 침전된 물질을 버립니다.
   5. 글리코칩을 배양실에 조심스럽게 넣습니다. 글리코칩 표면의 잔류 물질을 제거하기 위해 1mL의 Buffer-3를 사용하여 25°C에서 15분 동안 배양합니다.
   6. 글리코칩을 수직으로 잡고 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 Buffer-3 몇 방울로 다시 씻습니다. 여과지를 사용하여 글리코칩 표면에서 버퍼를 조심스럽게 제거합니다.

3. 반응 : 항체 결합

1. 글리코칩을 배양실에 넣습니다. 희석된 혈청 샘플을 마이크로피펫을 사용하여 글리코칩 표면에 펴 바릅니다. 37°C에서 1.5시간 동안 궤도 교반(30rpm)으로 배양합니다. 글리코칩 표면의 모든 건조 영역이 피펫 끝을 사용하여 희석된 혈청 샘플로 덮여 있는지 확인합니다.
2. 여분의 샘플을 제거하고 글리코칩을 25°C의 Buffer-3에 5분 동안 담그십시오. 그런 다음 글리코칩을 Buffer-4(5분)가 있는 용기로 옮기고 마지막으로 초순수로 글리코칩을 세척(5분)합니다. 글리코칩을 175 x g 및 25°C에서 1분 동안 원심분리하여 액체를 제거합니다.

4. 검출 : 2 차 항체

1. 글리코칩을 배양실에 넣습니다. 글리코칩 표면에 Buffer-2의 비오틴과 접합된 염소 항-마우스(IgG + IgM) 용액(5μg/mL)을 펴 바릅니다. 37°C에서 1시간 동안 궤도 교반(30rpm)으로 배양합니다.
2. 결합되지 않은 부분을 제거하고 세탁 단계를 반복하십시오.
3. 원심분리 후, 글리코칩을 25°C의 어둠 속에서 45분(30rpm) 동안 해당 플루오로크롬 표지 스트렙타비딘 용액 2μg/mL(버퍼-2)와 함께 배양합니다.
4. 어둠 속에서 결합되지 않은 부분을 제거하고 세탁 단계를 반복하십시오.
5. 글리코칩을 공기로 건조시킵니다.
   메모: 글리코칩은 가능한 한 빨리 스캔해야 합니다. 그러나 염색 직후 스캔이 불가능한 경우 글리코칩은 어두운 곳에서 서늘하고 건조한 곳에 보관할 수 있습니다.

3. 글라이칸 어레이 분석

1. 어레이 스캔
   1. 글리코칩이 어두운 곳에서 실온에 도달할 때까지 테이블 위에 두십시오. 동시에 슬라이드 스캐너와 레이저(여기 파장 633nm)를 켭니다.
   2. 마이크로어레이를 잡고 글리코칩이 뒤쪽에 닿을 때까지 슬롯에 밀어 넣습니다.
   3. 글리코칩을 스캔하고("run easy scan"), 스캔을 ". TIFF" 파일.

표 1: 글라이칸 목록, BALB/c 마우스(n = 20)의 자연 순환 항체(IgM + IgG)에 대한 결합, 상대 형광 단위(RFU)로 MAD 중앙값으로 발현± 컷오프를 초과하는 동물의 수(≥4000 RFU).이 표는 Bello-Gil, D. et al. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

결과

그림 1: 글라이칸 어레이 구성, 프린팅 및 분석의 개략도(규모가 아님).(A) 인쇄된 마이크로칩은 419개의 서로 다른 글라이칸 구조 라이브러리로 개발된 후 적절한 형광 표지된 2차 항체로 검출합니다. 각 슬라이드에는 6번 반복되는 4개의 서로 다른 하위 배열 블록(색상)이 포함되어 있습니다. 모든 단일 하위 어레이는 대조군을 포함하여 112개의 서로 다른 글라이칸 스폿(8개 행 × 14개 열)으로 형성됩니다. (B) 형광 스캐너를 이용한 마이크로칩 스캐닝으로부터 얻어진 이미지의 대표적인 예(이미지의 세 번째 부분). (C) "그리드"를 모든 단일 하위 어레이의 스폿에 정렬하는 프로세스(정량화 중 템플릿 조정). (

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
항 체
비오틴화 염소 항인간 Igs	Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬	레퍼런스 #: 31782
비오틴화 염소 안티 마우스 IgM + IgG	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제품 번호 #: 31807
설비
로봇 어레이어 sciFLEXARRAYER S5	Scienion AG, 독일 베를린	http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Stain Tray (슬라이드 배양 챔버)	Simport, Beloeil, QC, 캐나다	제품 번호 #: M920-2
원심 분리기	Eppendorf, 함부르크, 독일	제품 번호 #: 5810 R
피 펫	Gilson, Middleton, 위스콘신, 미국	http://www.gilson.com/en/Pipette/
슬라이드 스캐너	PerkinElmer, 미국 매사추세츠주 월섬	ScanArray GX 플러스
쉐이킹 인큐베이터	Cole-Parmer, 스태퍼드셔, 영국	참조 #: SI50
생물학적 시료
BALB/c 마우스 혈청	본 논문	해당 없음
복합 면역글로불린 제제(CIP)	Immuno-Gem, 모스크바, 러시아	http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
화학 물질, 시약 및 글라이칸
글라이칸 라이브러리	Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), 모스크바, 러시아	해당 없음
소 혈청 알부민(BSA)	시그마-알드리치, 세인트루이스, 미주리,	참조 #: A9418
에탄올아민	시그마-알드리치	제품 번호 #: 411000
트윈-20	Merck Chemicals & Life Science S.A., 마드리드, 스페인	참조 #: 655204
인산 완충 식염수(PBS)	VWR International Eurolab S.L, 바르셀로나, 스페인	제품 번호 #: E404
아지드화나트륨	시그마-알드리치	참조 #: S2002
Streptavidin Alexa Fluor 555 접합체	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제품 #: S21381
Streptavidin Cy5 접합체	GE Healthcare, Little Chalfont, 버킹엄셔, 영국	참조 #: PA45001
자료
N-하이드록시숙신이미드 유도체화 유리 슬라이드 H	Schott-Nexterion, 예나, 독일	참조 #: 1070936
Whatman 여과지	시그마-알드리치	참조 #: WHA10347509
1.5 mL 튜브	에펜도르프	참조 #: 0030120086
소프트웨어 및 알고리즘
ScanArray Express 마이크로어레이 분석 시스템	퍼킨엘머	http://www.per kinelmer.com/microarray

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