항체의 특이성 프로파일링을 위한 펩타이드 마이크로어레이 기술

초록

출처: Cornett, E. M., et al. 펩타이드 마이크로어레이를 사용한 히스톤 항체 특이성 분석. J. Vis. 특급 (2017).

이 비디오는 펩타이드 마이크로어레이 기술을 적용하여 히스톤 펩타이드에 대한 PTM(Post-Translational Modification)을 인식하는 항체의 특이성을 프로파일링하는 기술을 보여줍니다. 알려진 PTM 조합과 함께 고정된 형광단 접합 히스톤 펩타이드를 포함하는 마이크로어레이 슬라이드를 표적 PTM 특이적 항체로 처리합니다. 이 프로세스는 표적에 대한 항체의 특이성과 비표적 PTM과의 잠재적인 교차 반응을 식별하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 어레이 슬라이드 및 소스 플레이트 레이아웃 설계

1. ArrayNinja 인터페이스의 '슬라이드 레이아웃 계획' 제목 아래에서 사용 중인 마이크로어레이 프린터에 해당하는 링크를 클릭합니다.
   메모: ArrayNinja는 일반적으로 사용되는 두 개의 마이크로어레이 프린터의 로봇 움직임을 모방하도록 프로그래밍되었습니다(표 1 참조). 다른 arrayer와의 호환성은 요청 시 구성할 수 있습니다.
2. 'Load plate' 대화 상자 내부를 클릭하고 "empty"를 입력한 다음 'enter'를 클릭합니다. ArrayNinja 디자인 모듈의 스크린샷은 그림 1을 참조하십시오.
3. 스폿 직경을 275μm로, 스폿 간격을 375μm로 조정합니다. 나머지 설정(플레이트 블록/플레이트 행, 총 플레이트 행, 복제, y의 피처, 슈퍼 어레이, SuperA 퍼지, 그림 1 참조)을 조정하여 피처가 마이크로어레이 슬라이드에 표시되는 방식을 사용자 정의합니다.
   메모: 스폿 직경은 마이크로어레이 핀의 크기에 의해 결정됩니다. 이러한 설정이 조정되면 만화 슬라이드가 실시간으로 업데이트됩니다. 이 만화를 사용하여 각 설정이 최종 슬라이드 레이아웃을 어떻게 수정하는지 미리 볼 수 있습니다.
4. 슬라이드의 피처 레이아웃이 완료된 후 각 고유 피처 위에 마우스를 올려놓고 팝업 대화 상자에 피처 식별자를 입력합니다.
   메모: 기능 식별자는 숫자, 문자 또는 조합으로 구성될 수 있습니다. 이는 고유 피쳐에만 필요하며, 복제가 선택되면 대화 상자가 나타나지 않습니다.
5. 모든 고유 기능에 식별자가 할당되면 '채우기'를 클릭합니다. 슬라이드 레이아웃의 이름을 입력하고 '플레이트 인쇄'를 클릭하여 저장합니다. 선택한 슬라이드 설계를 제작하는 데 필요한 384웰 소스 플레이트의 수와 소스 플레이트에 로드할 각 피쳐의 물리적 위치를 매핑하는 테이블을 표시하는 새 페이지가 열립니다.
   메모: 마이크로어레이 데이터를 분석할 때 이 설계를 떠올리는 데 사용되므로 이 이름을 기억하십시오. 'print your plate'를 클릭하면 ArrayNinja 내에 레이아웃이 저장됩니다.

2. 마이크로 어레이 제작

1. 소스 플레이트 준비
   1. ArrayNinja로 생성된 맵을 사용하여 384웰 소스 플레이트를 만듭니다.
      참고: 이 플랫폼에서 쿼리된 펩타이드에 대한 자세한 설명은 다른 곳에서 찾을 수 있습니다.
   2. 각 특징(예: 비오틴화된 히스톤 펩타이드)의 1 - 2 μL를 384-well source plate의 올바른 well에 증착합니다
      메모: 비오틴화된 히스톤 펩타이드는 일반적으로 200 - 400 μM 원액에서 증착되며, 이는 단일 어레이 스폿에서 스트렙타비딘 결합 부위에 대한 펩타이드의 10-25배 몰 초과량과 같습니다. 이것은 다음 방정식을 사용하여 계산됩니다.
      
      여기서 V는 핀이 전달하는 부피, [P]는 인쇄되는 피처의 농도, NA는 아보가드로 수, S는 스폿의 표면적입니다. C는 슬라이드의 적용 범위로, 단위 면적당 스트렙타비딘 분자 수에 3을 곱한 값(사용 가능한 스트렙타비딘 결합 부위의 평균 수)으로 표시됩니다. V와 C는 해당 제조업체에서 얻습니다. 다른 기능은 밀집이 문제가 될 수 있는 생체 분자의 크기에 따라 다른 농도를 필요로 할 수 있습니다. 최적의 인쇄 농도를 결정하기 위해 각각의 새로운 유형의 기능에 대한 인쇄 농도 범위를 경험적으로 테스트해야 합니다.
   3. 1% 소 혈청 알부민(BSA)이 보충된 1x 프린팅 버퍼로 각 기능을 10배 희석합니다. 소스 플레이트를 실온에서 500 x g에서 2분 동안 돌립니다.
      메모: 인쇄 버퍼에 플루오레세인 표지 비오틴(5μg/μL)을 포함하는 것은 스포팅 제어 및 분석 중 적절한 어레이 정렬을 용이하게 하기 위한 시각적 보조 도구로 권장됩니다(그림 3 참조).
2. 인쇄 프로토콜(그림 2A – B).
   1. 쓰레기 수거통을 비우고 세척액통과 가습기통에 멸균 증류수를 채워 어레이어를 준비합니다.
   2. ArrayNinja(그림 1)의 슬라이드를 설계하는 데 사용되는 매개변수를 마이크로어레이 프린터 제어 프로그램에 입력합니다.
   3. 마이크로어레이 프린터 제어 프로그램을 사용하여 한 번의 침지로 1초 세척으로 세척 절차를 설정합니다. 각 세탁 후 핀을 5회 다시 담그도록 세탁 후 설정을 지정합니다. 습도를 60%.
      로 설정합니다. 메모: 최적의 세척 구성은 사용 중인 마이크로어레이 프린터에 따라 달라질 수 있습니다. 최적의 세척 후 핀 딥 구성은 사용 중인 마이크로어레이 프린터에 따라 달라질 수 있습니다.
   4. 기능화된 슬라이드(예: 스트렙타비딘 코팅 유리)를 기판 플래튼에 삽입하고 모든 플래튼을 플래튼 엘리베이터에 넣습니다. 소스 플레이트를 플레이트 홀더에 삽입하고 소스 플레이트 엘리베이터에 넣습니다.
   5. '인쇄'를 클릭합니다. 몇 차례의 피처 증착에 대한 인쇄 프로세스를 모니터링하여 모든 세척 및 침지 설정이 올바른지 확인합니다. 인쇄 실행이 완료되면 arrayer.
      에서 기판 플래튼을 제거합니다. 메모: 대형 인쇄 실행으로 인해 하루 이내에 차단 단계를 완료할 수 없는 경우, 인쇄된 슬라이드를 4°C의 가습 챔버에서 밤새 배양할 수 있습니다. 플라스틱 랩으로 밀봉된 판지 상자 안의 작은 물 비커 옆에서 슬라이드를 배양합니다.
   6. 블로킹 버퍼로 슬라이드를 실온에서 30분 동안 블링하여 혼합하여 막습니다.
   7. 실온에서 2 x 10분 동안 혼합하여 pH 7.6의 인산염 완충 식염수(PBS)로 슬라이드를 세척합니다. 마이크로어레이 슬라이드 원심분리기에서 실온에서 30초 동안 회전시켜 슬라이드를 건조시킵니다.
      메모: 한 번에 많은 수의 슬라이드를 처리하기 위해 고처리량 현미경 슬라이드 세척실을 사용하여 50개의 슬라이드를 병렬로 세척할 수 있습니다.
   8. 왁스로 칸막이하도록 설계된 슬라이드의 경우 섹션 2.1로 진행하십시오. 다른 모든 디자인의 경우 빛과 습기로부터 보호되는 4°C에서 슬라이드를 보관하십시오.
      메모: 인쇄된 비오틴화 히스톤 펩타이드는 이러한 방식으로 보관할 경우 최소 6개월 동안 안정적입니다.

2. 마이크로어레이 슬라이드 파티셔닝

1. 소수성 왁스 펜(그림 2C)
   1. 왁스 펜을 사용하여 특징이 포함된 영역 주위에 왁스를 바릅니다. 섹션 3.
      로 진행하기 전에 왁스를 5분 동안 자연 건조시킵니다. 메모: 블로킹 후에는 어레이 스폿을 눈으로 시각화하기가 매우 어려울 수 있습니다. ArrayNinja의 슬라이드 디자인은 크기에 맞게 인쇄하여 왁스를 적용하기 위한 가이드로 사용할 수 있습니다.
2. 실리콘 개스킷(그림 2D)
   1. 어레이 개스킷 뒷면에서 투명 필름을 벗겨내고 접착면을 아래로 향하게 하여 마이크로어레이 슬라이드에 놓습니다.
   2. 섹션 5로 진행하기 전에 개스킷을 3초 동안 제자리에 고정하십시오.
3. 왁스 임프린트(그림 2E)
   1. 왁스로 분할하도록 설계된 슬라이드의 경우 10% BSA를 사용하여 일반 유리에 테스트 슬라이드를 인쇄합니다. 이 테스트 슬라이드를 사용하여 왁스 임프린터 가이드 또는 어레이 설정을 최적화하여 모든 기능이 왁스 몰드 챔버 내에 있는지 확인하십시오.
   2. 모든 왁스가 완전히 녹을 때까지 마이크로어레이 왁스 임프린터를 85°C로 약 30분 동안 가열합니다.
   3. 인쇄면이 아래를 향하도록 슬라이드를 삽입하고 슬라이드를 마이크로어레이 임프린터의 오른쪽 가이드까지 끝까지 밉니다. 레버를 위로 당겨 금형이 슬라이드 표면과 접촉하도록 합니다. 2초 동안 유지
      메모: 최적의 왁스 테두리 두께를 얻기 위해 유지 시간을 변경할 수 있습니다.
   4. 슬라이드를 신속하게 제거하고 왁스 테두리를 육안으로 검사하여 모든 웰이 밀폐되어 있고 테두리가 너무 두꺼워서 반점을 침범하지 않는지 확인합니다. 슬라이드는 습기와 빛으로부터 보호되는 4°C에서 보관하십시오.
      메모: 더 두껍거나 더 얇은 테두리를 얻기 위해 보류 시간을 늘리거나 줄일 수 있습니다.

3. 히스톤 PTM 항체와 펩타이드 마이크로어레이 하이브리드화

1. 혼성화 완충액(PBS, pH 7.6, 5% BSA, 0.1% Tween-20)을 준비합니다.
2. hybridization vessel을 사용하여 hybridization buffer에서 슬라이드를 평형화합니다. 혼성화 완충액의 전체 슬라이드를 완전히 덮고 오비탈 쉐이커에서 4°C에서 저속으로 30분 동안 배양합니다.
3. 혼성화 buffer.
   에 희석된 히스톤 PTM 항체가 포함된 용액을 준비합니다. 메모: 예시 데이터에서, 히스톤 항체 #1과 항체 #2는 모두 혼성화 완충액에서 1:1,000으로 희석되었습니다. 면역 블로팅에 사용되는 것과 유사한 희석 범위가 시작점으로 권장됩니다.
4. 항체 용액과 함께 어레이를 4°C에서 1시간 동안 배양합니다. 항체 용액을 제거하고 어레이를 4°C에서 차가운 PBS, pH 7.6으로 5분 동안 3회 세척합니다.
5. 1:5,000 - 1:10,000 희석된 형광 염료 접합 2차 항체를 혼성화 완충액에 준비합니다.
6. 빛으로부터 보호된 4°C에서 30분 동안 2차 항체 용액으로 어레이를 배양합니다. 2차 항체 용액을 제거하고 마이크로어레이 슬라이드를 PBS, pH 7.6으로 4°C에서 5분 동안 3회 세척합니다. 0.1x PBS, pH 7.6을 함유한 50mL 원뿔형 튜브에 마이크로어레이를 담궈 실온에서 과도한 염분을 제거합니다. 실온에서 마이크로어레이 슬라이드 원심분리기로 슬라이드를 건조시킵니다.
7. 마이크로어레이 스캐너 제조업체에서 권장하는 스캐닝 프로토콜에 따라 25μm 이상의 해상도로 마이크로어레이 스캐너로 슬라이드를 스캔합니다.
   메모: 플루오레세인 표지 비오틴 추적자가 존재하는 경우 녹색 채널(예: 488nm, em: 509nm)과 형광 염료 접합 2차 항체(일반적으로 빨간색(예: 635nm, em: 677nm)에 해당하는 채널을 모두 스캔합니다. 스캔의 목표는 단일 .png 파일로 병합할 수 있는 단일 채널 .tif 파일을 얻는 것입니다.

결과

그림 1 : ArrayNinja 디자인 모듈. ArrayNinja 디자인 모듈의 스크린샷이 점선으로 표시되어 있습니다. 제어판(상단)에는 마이크로어레이 프린터에서 변경할 수 있는 모든 매개변수가 표시됩니다. 이러한 매개변수가 조정되면 슬라이드 레이아웃(왼쪽 하단)의 만화 이미지가 실시간으로 업데이트됩니다. 레이아웃이 설정되면 사용자는 개별 지점 위로 마우스를 가져가 고유한 기능 식별자를 입력할 수 있습니다. ArrayNinja는 이 사용자 입력에서 지정된 마이크로어레이 슬라이드 레이아웃을 제작하는 데 필요한 소스 플레이트(오른쪽 하단)의 각 기능 위치 맵을 구성합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인쇄 버퍼	어레이잇	증권 시세
증권 시세	옴니퓨어	2390
Streptavidin-coated 유리 현미경 슬라이드	그라이너 바이오 원	제439003-25
폴리프로필렌 384웰 플레이트	그라이너 바이오 원	784201
비오틴-플루오레세인	시그마	53608
Microarray 프린터 접촉	오숀	2470	Aushon 2470 마이크로어레이 프린터
Microarray 프린터 접촉	유전자 기계	옴니그리드 100	OmniGrid Microarray 프린터
PBS (PBS)	인비트로젠	14190
블로킹 버퍼	어레이잇	증권 시세
소수성 왁스 펜	벡터 랩스	H-4000	ImmEdge 소수성 배리어 PAP 펜
실리콘 개스킷	그레이스 바이오 랩스	622511
하이브리드화 용기	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	267061	또는 이와 유사한 선박
형광 염료 접합 2차 항체	생명 기술	A-21244	Alexa Fluor 647 (토끼 퇴치)
형광 염료 접합 2차 항체	생명 기술	A-21235	Alexa Fluor 647(마우스 방지)
왁스 임프린터	어레이잇	MSI48
트윈-20	옴니퓨어	9490
Microarray 스캐너	이노시스	이노스캔 1100AL	또는 동등한 microarray 스캐너
EipTitan 히스톤 펩타이드 마이크로어레이	에피키퍼	112001
AbSurance Pro 히스톤 펩타이드 마이크로어레이	밀리포어	16668
MODified 히스톤 펩타이드 어레이	액티브 모티프	13001
히스톤 코드 펩타이드 마이크로어레이	증권 시세	His_MA_01
밀랍	로얄 오크	걸프왁스	왁스 임프린터용
가습된 마이크로어레이 슬라이드 혼성화 챔버	폭스바겐	97000-284
고처리량 현미경 슬라이드 세척실	어레이잇	증권 시세
현미경 슬라이드 원심분리기	폭스바겐	93000-204
항체 1	아브캠	8898
항체 2	밀리포어	07-473
비오틴화 히스톤 펩타이드	에피사이퍼	2001년 12월	펩타이드의 예. 다양한 변형을 가진 유사한 펩타이드는 여러 상업적 출처에서 구할 수 있습니다.
이미지매직(ImageMagick)			https://www.imagemagick.org/script/index.php
어레이닌자			https://rothbartlab.vai.org/tools/