제브라피시 방사상 신경교세포(Radial Glia progenitor)에서 Notch/DeltaD 신호 전달을 이미징하기 위한 항체 흡수 분석

초록

출처: Zhao, X. et al., 제브라피시 방사상 신경교세포의 비대칭 분열 중 노치/델타 내포작용 추적을 위한 항체 흡수 분석.J. Vis. 특급 (2023)

이 비디오는 제브라피시 방사상 신경교세포에서 Notch/DeltaD 신호를 이미지화하기 위한 항체 흡수 분석을 보여줍니다. 여기에는 아가로스가 박힌 탈이온화된 제브라피시 배아를 장착하고, 망막 신경절 세포에 DeltaD 리간드를 표적으로 하는 염료 용액을 주입하고, 비대칭 세포 분열을 위해 형광 현미경으로 이미징하여 Notch/DeltaD 신호 활성화를 확인하는 작업이 포함됩니다.

프로토콜

1. 제브라피시 배아의 준비

1. 오후 5:00 이전에 암컷 야생형 물고기 한 마리와 수컷 Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] 물고기 한 마리를 칸막이를 사용하여 각 수조에서 분리하여 물고기 횡단 수조를 설치합니다.
2. 다음날 아침 모든 건널목 탱크에서 오전 11:00 이전에 칸막이를 제거하십시오. 물고기가 짝짓기를 하는 동안 조용히 하고 방해하지 마십시오. 산란은 일반적으로 칸막이를 제거한 후 30분 이내에 발생합니다. 수정란은 탱크 바닥에 남아 있습니다.
   1. 메쉬 필터로 탱크에서 수정란을 수집합니다. 난자를 씻어내어 달걀 물이 가득 찬 페트리 접시에 옮기고 10배에서 20배 배율로 해부 현미경으로 배아를 검사합니다.
3. 수정된 배아를 약 20mL의 배아 배지(1,000x 스톡 용액 100mL에는 염화나트륨(NaCl) 29.4g, 염화칼륨(KCl) 1.27g, 염화칼슘 4.85g, 이수화물(CaCl 2.2H2O) 및 황산마그네슘 헵타하이드레이트 8.13g(MgSO 4.7H2O)) 대형 보어 유리 파스퇴르 피펫 포함. 배아를 28 °C로 유지하십시오. 28.5 °C에서 30mL의 배아 배지와 함께 페트리 접시 당 50 개의 수정 배아를 유지하십시오.
   참고: 한 쌍의 물고기는 일반적으로 100-300개의 배아를 생산하며, 건강한 배아의 수정 및 생존율은 짝짓기 한 번당 95% 이상입니다.
4. 다음날 아침, 배아가 수정 후 ~18-20시간(hpf)의 발달 단계에 도달한 오전 8:00에 인큐베이터에서 배아를 꺼냅니다. 처음에는 백색광을 사용하여 20배 배율로 상피 형광 현미경으로 관찰합니다. 그 때 제브라피시 배아는 20-somite 단계에 있습니다.
   1. 현미경 아래에서 탁하거나 파열된 죽은 배아는 유리 피펫을 사용하여 폐기합니다.
5. 형광등을 켜고 현미경의 적색 형광 단백질(RFP) 필터 설정을 선택합니다. 그런 다음 붉은 형광이 강한 배아를 선택하고 달걀 물이 담긴 새 접시에 옮깁니다.
   1. 백색광 아래에서 두 개의 미세한 집게(집게 끝은 날카롭고 손상되지 않아야 함)로 배아를 수동으로 분리합니다(Table of Materials).
   2. 한 쌍의 집게로 융모막을 잡고 다른 집게로 합창단을 찢습니다. 집게를 사용하여 찢어진 부분을 조심스럽게 열고 다른 집게 끝으로 배아를 부드럽게 밀어 배아가 통과할 수 있을 만큼 크게 만듭니다.
6. 미세주입 전에 빠르게 헹굴 수 있도록 새로운 배아 배지가 있는 새로운 페트리 접시에 디코리온화된 배아를 옮깁니다.

2. 미세주입 준비

1. 모세관(1.2mm 외경(OD), 0.9mm 내경(ID), 필라멘트 포함)을 사용하여 풀러에서 미세한 주사 바늘을 당깁니다. 핸드북에 따라 당기는 프로그램을 설계하고 최적화합니다.
2. 실체 해부 현미경 아래에서 집게로 바늘 끝을 엽니다. 팁의 직경을 약 10μm, 테이퍼 각도를 약 30°로 만듭니다.
3. 주입 전에 마우스 단클론 항-Dld 항체를 anti-Mouse-IgG-Atto647N과 접합합니다.
   1. 각 주입 실험에 대해 0.5 μL의 항-Dld 항체(0.5 mg/mL)와 2 μL의 항-Mouse-IgG-Atto647N 항체(1 mg/mL)를 5-10회 피펫팅하여 혼합합니다. 그런 다음 실온에서 최소 30분 동안(또는 얼음 위에서 2-3시간 동안) 배양합니다.
   2. 배양 후, 항체 혼합물에 2.5μL의 차단 완충액(10mg/mL 마우스 IgG)과 0.5μL의 0.5% 페놀 레드를 첨가하고 혼합물에 남아 있는 접합되지 않은 항체를 차단하기 위해 완전히 혼합한 피펫 10x를 추가합니다.
      메모: 각 시험에 대해 항-Dld 항체가 없는 혼합물을 하나 더 준비하고 대조군으로 사용합니다.
4. 배아 배지에서 1% 저융점 아가로스를 준비합니다. 아가로스 함유 혼합물이 투명해질 때까지 70°C에서 가열합니다.
   1. 아가로스 용액을 2mL 마이크로 원심분리 튜브에 분주량으로 추출합니다. 부분 표본을 ~40°C의 가열 블록에 보관하십시오.
5. 1%의 저융점 아가로스가 함유된 튜브에서 배아를 3초 동안 헹굽니다.
6. 그림 1과 같이 배아를 거꾸로 된 플라스틱 페트리 접시 뚜껑에 개별 아가로스 방울(~30-40 μL)과 함께 놓고 각 배아를 뚜껑에 별도로 장착합니다. 배아를 아가로스에 옆으로 평평하게 놓고 아가로스가 실온에서 응고될 때까지 이 위치를 유지합니다.
7. 위와 같이 12개의 배아를 3줄로 하나씩 장착합니다. 아가로스에 장착된 모든 배아를 난자 배지로 덮습니다.

3. 미세주입

1. 내장된 배아를 실체현미경 아래에 놓고 아가로스를 난자로 덮습니다.
2. 공기 압력 주입기를 마이크로 매니퓰레이터와 함께 설정하고 그림 1과 같이 현미경에 가깝게 배치합니다. 고압에서 기체 질소(N₂)가 포함된 강철 가스 실린더를 공기 자원으로 사용하십시오.
   1. 배아가 아가로스에 장착된 후에만 가스 밸브를 엽니다. 그런 다음 마이크로인젝터의 전면 주입 모듈을 사용할 때 그림 1과 같이 준비된 유리 바늘에 2μL의 항체 혼합물을 마이크로매니퓰레이터에 전면에 로드합니다.
   2. 입력 압력을 ~80-90psi로 조정하고 사출 압력을 ~20psi로 조정합니다.
3. 앞에서 설명한 대로 현미경 아래의 마이크로미터를 사용하여 주입량을 보정합니다. 바늘이 열리는 크기에 따라 튜닝 시간 지속 시간을 10ms에서 120ms로 설정합니다. 패들을 두드려 각 주입 펄스를 전달합니다. 각 전달의 주입량을 ~4-5nL로 조정합니다.
4. 미세주입 바늘 끝을 후뇌 후방의 등지붕판을 통해 r0/r1 힌지 지점까지 찔러넣고 뇌 조직에 닿지 않고 약 10nL(2개 또는 3개의 펄스)의 항체 혼합물을 주입합니다. 뇌실에서 붉은 액체가 흐르는 것을 관찰하십시오.
   메모: 후뇌뇌실(hindbrain cortricle)은 중뇌 후뇌 경계(midbrain hindbrain boundary)의 후방에 있습니다. 주입된 페놀 레드 함유 항체 혼합물은 뇌척수액으로 확산되어 후뇌에서 전뇌까지 뇌실을 즉시 채웁니다.
5. 주입 후 마이크로 매니퓰레이터의 손잡이를 돌려 배아에서 바늘 끝을 신속하게 제거합니다. 성공적인 주입을 위해서는 주입된 혼합물의 붉은 염료가 주변의 아가로스로 누출되지 않고 뇌심실에 안정적으로 남아 있어야 합니다.
6. 장착 플레이트를 현미경 아래로 이동하여 반복을 위한 적절한 위치에 장착된 다른 배아를 찾습니다.
   1. 6-8개의 배아를 주입한 후 미세수술용 칼로 아가로스를 껍질을 벗겨 박힌 아가로스에서 배아를 방출합니다. 미세주입된 배아를 30mL의 배아 배지가 있는 신선한 접시에 옮기고 다음 단계를 위해 실온에 놓습니다.

4. 마운팅 및 타임랩스 라이브 이미징

1. 30분 후, 선택한 배아를 10mL의 배아 배지로 옮깁니다. 배아 배지 10mL에 트리카인 스톡 420μL(4mg/mL)를 첨가하여 배아를 마취합니다.
2. 배아를 장착하려면 튜브에 동일한 농도의 트리카인을 함유한 0.8% 저융점 아가로스를 준비합니다. 부분 표본을 ~40°C의 가열 블록에 보관하십시오.
3. 유리 피펫을 사용하여 주입된 배아를 따뜻한 아가로스에 3초 동안 담그십시오. 그런 다음 즉시 동일한 유리 피펫으로 아가로스에서 배아를 제거하고 튜브에서 아가로스 한 방울과 함께 35mm 유리 바닥 배양 접시의 중앙에 배아를 놓습니다. 유리잔에 한 방울당 하나의 배아만 놓습니다.
4. 섬유 프로브 또는 로딩 팁으로 배아의 방향을 부드럽게 잡아 배아 뇌의 등쪽을 유리 바닥에 최대한 가깝게 유지합니다. 배아 위치를 부드럽게 조정하여 아가로스가 점차적으로 응고됨에 따라 말리지 않고 배아를 확장합니다.
5. 그 후, 유리 바닥 접시를 뒤집어 배아 위치를 확인합니다. 올바르게 장착된 배아가 있는 전체 등쪽 전뇌가 현미경으로 볼 수 있는지 확인합니다.
6. 배아를 덮기 위해 트리카인을 함유한 28.5°C의 예열된 배아 배지 2-3mL를 추가합니다. 그림 1과 같이 컨포칼 현미경의 온도 제어 스테이지에 접시를 적절하게 놓습니다. 이미징 챔버의 온도를 28.5°C로 조정합니다. 이제 배아를 이미징할 준비가 되었습니다.

결과

그림 1: 실험 단계의 순서도.MyR-Tdtomato 리포터를 발현하는 형질전환 제브라피시는 1일차에 AB 야생형과 교배됩니다. 2일차에는 미세 주입을 위해 적색 형광 배아를 선택한 후 시간 경과 이미징을 수행합니다. 2^일차의 전체 실험에는 약 8시간이 소요됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
35mm 유리 바닥 문화 접시	MatTek 주식회사	P35GC-1.5-10-씨
공기압 인젝터	나리시게	IM300
안티 마우스 - IgG-Atto647N	시그마-알드리치	50185
칼슘2.2H2O	시그마-알드리치	C3306 (영문
캐필러리, 1.2mm OD, 0.9mm ID, 필라멘트 포함	세계적인 정밀 기기	AN-번호 1B120F-6
CSU-W1 스피닝 디스크/고속 광시야	니킨	해당 사항 없음	Nikon Ti 도립 형광 현미경, CSU-W1 대 시야 컨포칼.
Dumont 의료용 핀셋 스타일 5	토마스 사이언티픽	72877-디
플레밍 브라운 P897 풀러	셔터 기기	해당 사항 없음	https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf
케이클	밀리포어	529552
마그네슘SO4.7H2O	시그마-알드리치	M2773
마이크로 매니퓰레이터	세계적인 정밀 기기	WPI M3301R
마우스 안티 DLD	아브캠	AB_1268496
Zenon의 마우스 IgG 차단 버퍼	써모피셔 사이언티픽	Z25008
염화나트륨	시그마-알드리치	S3014
페놀 레드	시그마-알드리치	P0290
스테미 2000	자이스	해당 사항 없음
트리카인	시그마-알드리치	E10521
UltraPureTM 저융점 아가로스	인비트로젠	16520050

시리즈 년 )