식물 조직에서 아라비노갈락탄 단백질과 펙틴의 면역 국소화

초록

출처: Costa, M., et al. 식물 조직의 세포벽에 있는 아라비노갈락탄 단백질과 펙틴의 형광 면역 국소화. J. Vis. 특급 (2021).

이 동영상은 식물 조직에서 아라비노갈락탄 단백질(AGP)과 펙틴을 국소화하는 면역염색 기술을 보여줍니다. 고정 및 수지 포매 식물 조직 절편은 AGP 및 펙틴 특이적 1차 및 형광 2차 항체와 셀룰로오스 결합 형광 염료로 염색되어 세포벽에서 조직 특이적 공동 국소화를 나타냅니다.

프로토콜

1. 면역 국소화

참고: 형광 면역국소화 절차는 두 항체의 순차적 사용에 의존합니다. 1차 항체는 특정 표적 항원에 대해 발생합니다. 2차 항체는 1차 항체에 대해 특이적으로 증가하며, 형광 기술의 경우 형광단(이 특정 프로토콜에서는 FITC[fluorescein isothiocyanate])에 접합됩니다. 1차 항체는 샘플에서 표적 항원을 검출하는 데 사용되며, 2차 항체는 1차 항체의 초과분을 씻어낸 후 1차 항체가 샘플에 연결된 위치를 표시하는 데 사용됩니다. 대조군은 이 분석의 중요한 부분이며 관찰의 정확성을 보장하기 위해 항상 수행해야 합니다. 슬라이드의 한 웰은 음성 대조군으로 사용하기 위해 남겨두어야 하며, 여기서 1차 항체 처리는 건너뛰므로 실험이 끝날 때 신호가 관찰되어서는 안 됩니다. 양성 대조군은 표지가 이미 알려져 있고 확실한 항체로 하나를 처리하여 실험에 포함되어야 합니다. 양성 대조군은 2차 항체 표지 효과 및 반응 조건을 확인하는 데 사용되며, 음성 대조군은 2차 항체 특이성을 검사하는 데 사용됩니다.

1. 피펫 팁 상자 바닥에 d를 댐 종이 타월을 놓고 은박지로 싸서 배양실을 준비합니다(그림 1B-1E). 슬라이드를 배양실에 놓습니다.
2. 차단 용액(1M 인산염 완충 식염수[PBS]에 5% 무지방 분유(w/v)) 8mm 웰당 50μL 방울을 피펫으로 넣고 10분 동안 배양합니다. 차단 용액을 제거하고 10분 동안 PBS로 모든 웰을 두 번 세척합니다.
3. 블로킹 용액에서 1차 항체 용액(표 1 참조), 1:5 (v/v) 항체를 준비합니다. 8mm 웰당 약 40μL를 추정합니다.
   메모: 항체의 농도는 제조업체의 프로토콜에 따라 조정해야 합니다.
4. 이중 증류수(ddH₂O)로 5분 동안 최종 세척을 수행하고 우물이 완전히 건조되지 않도록 하십시오.
5. 반응 웰에 대한 1차 항체 용액을 피펫팅합니다. 제어 웰에 대한 피펫 차단 용액.
6. 배양 챔버를 닫고 실온에서 2시간 동안 방치한 후 4°C에서 하룻밤 동안 방치합니다.2차 항체 용액을 1%의 차단 용액(v/v)에 넣어 웰당 약 40μL로 준비합니다. 은박지로 덮으십시오.
7. PBS로 모든 웰을 10분 동안 두 번 세척한 다음 ddH₂O로 10분 더 세척합니다. 웰에 차단 용액이나 침전물의 흔적이 보이지 않는지 확인하십시오.
8. 2차 항체 용액을 모든 웰에 피펫팅합니다. 이제부터 슬라이드를 빛으로부터 보호하십시오.
9. 실온에서 어두운 곳에서 3-4시간 동안 배양합니다.
10. PBS로 10분 동안 모든 웰을 두 번 세척한 다음 ddH₂O로 10분 동안 다시 세척합니다.
11. 각 웰에 calcofluor 한 방울(1:10,000 (w/v) 형광등, PBS에서 더 밝게, 28)을 바릅니다. 세척하지 않고 각 웰에 장착 매체 한 방울(재료 표 참조)을 바르고 커버슬립(그림 2H)을 놓습니다.
12. 10x/0.45, 20x/0.75, 40x/0.95 및 100x/1.40 렌즈가 장착된 형광 현미경으로 관찰하고 UV(calcofluor 염색용) 및 FITC 필터를 사용하여 각각 세포벽과 면역 국소화를 검출합니다(그림 2I). UV의 경우 여기/방출(nm) 358/461, FITC의 경우 485/530 파장을 사용합니다.
13. 결과를 더 잘 시각화하려면 두 이미지를 ImageJ 또는 이와 유사한 이미지와 겹칩니다.

표 1: 유용한 단클론 항체 목록. 위의 표는 사용 가능한 항체의 예를 나타내며, 항체의 표적 및 항체를 구매할 수 있는 위치에 대한 정보가 포함되어 있습니다.

시리즈 시리즈 시리즈 시리즈 시리즈 시리즈 시리즈 시리즈

이름	선호도	사용 가능 위치
LM2	아라비노갈락탄 단백질	플랜트 프로브(영국 리즈)
LM5	펙틴
LM6	아라비나
LM7	호모갈락투로난
LM8	자일로갈락투로난
LM13	(1-5)-A-L-아라비난
LM14	아라비노갈락탄 단백질
LM16	가공된 아라비난 - RG-I
LM18	호모갈락투로난
LM19	호모갈락투로난
LM20	호모갈락투로난
LM26	분기 - 갈락탄
LM30	아라비노갈락탄 단백질
짐5	낮은 메틸 에스테르화 호모갈락투로난	CCRC (조지아, 미국)
짐7	고도의 메틸 에스테르화 호모갈락투로난
짐4	아라비노갈락탄 단백질
짐8	아라비노갈락탄 단백질
짐13	아라비노갈락탄 단백질
짐15	아라비노갈락탄 단백질
짐16	아라비노갈락탄 단백질
짐20	익스텐신
맥207	아라비노갈락탄 단백질

결과

그림 1. (A) 초박 절편기로 절단하기 위해 샘플(노란색 블록)을 준비하기 위한 블록 트리밍 순서의 개략도. 먼저 젤라틴 캡슐을 제거합니다(1). 그런 다음 먼저 샘플(2)에 접선으로 캡슐 측면에 대해 40°에서 45° 각도로 트리밍하고, 첫 번째(3)의 90°에서 두 번째 절단을 한 다음 동일한 규칙(5)에 따라 세 번째(4) 및 네 번째 절단을 수행합니다. 이 트리밍의 첫 번째 단계에서 정상이 샘플 위에 위치하는 피라미드 모양의 구조가 생성됩니다. 마지막으로, 날카로운 칼날로 정상 회담을 수지 블록 장축에 수직으로 깎아 내서 내장 된 샘플에 도달합니다. 절차가 끝날 때 정사각형 또는 사다리꼴 표면을 얻어야 합니다(6). (B) 배양실을 만드는 데 필요한 물품 은박지(1), 양면 덕트 테이프(2), 종이 타월(3) ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
8웰 유리 반응 슬라이드	마린펠트	MARI1216750	다른 브랜드를 사용할 수 있습니다.
Anti-Rat IgG (wole molecule)-FITC 항체는 GOAT에서 생산됩니다	시그마-알드리치	F6258
커버 슬립, 24 mm x 50 mm	마린펠트	MARI0100222	커버 슬립은 모든 우물을 덮어야 합니다. 다른 브랜드를 사용할 수 있습니다.
ddH2O	나	나
에탄올 앱솔루트	나	나
형광등 brightner 28	시그마-알드리치	F-6259
무지방 분유	네슬레	나	무지방 분유가 적당합니다.
오븐	나	나	일반 실험실 오븐
쥐가 생성한 단클론 항체	플랜트 프로브	나	세포벽 성분을 인식하는 여러 항체는 복합 탄수화물 연구 센터(CCRC, Georgia University USA)와 Plant Probes(Paul Knox Cell Wall Lab, Leeds University UK)에서 모두 사용할 수 있습니다. 일반적으로 사용되는 몇 가지 MABS와 구매할 수 있는 위치에 대한 간략한 목록이 보충 표 1에 나와
UV 및 FITC 형광 필터를 사용한 정립 에피 형광 현미경	라이카 마이크로시스템	디엠엘비
진공 챔버	나	나
진공 펌프	나	나
벡타쉴드	vecta 연구소	T-1000	다른 페이드 방지 기능을 사용할 수 있습니다. FITC 및 Fluorescente brightner 28과의 호환성을 확인하십시오. (참고: 비상업적 대안의 경우(Jonhson et al 198218 참조) 9:1(v/v) 글리세롤에 25mg/mL의 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane(DABCO)을 1xPBS에 혼합하여 퇴색 방지 배지를 만들 수 있습니다. 희석된 HCl로 pH를 8.6으로 조정합니다.)

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