샌드위치 ELISA를 사용하여 백신의 면역원성 당단백질 함량 측정

초록

출처: Jallet, C. et al., 광견병 백신 효능을 평가하기 위한 체외 ELISA 테스트.J. Vis. 특급 (2020)

이 동영상은 백신의 면역원성 당단백질 수치를 평가하기 위해 고안된 간접 효소 결합 면역흡착 분석 또는 ELISA 샌드위치 면역포획 분석을 보여줍니다. 당단백질 특이적 항체를 포함하는 분석 플레이트는 참조 및 테스트 백신을 포함하여 연속적으로 희석된 백신 샘플과 함께 배양된 후 면역 분석을 통해 테스트 백신의 당단백질 함량을 정량화합니다.

프로토콜

1. 보안 예방 조치

참고: 이 방법은 광견병 생백신(RABV)과 불활성화 백신 모두에 적용할 수 있습니다.

1. 우수한 실험실 관리 및 안전 절차를 사용하십시오.
2. 일회용 코트, 장갑, 마스크, 안경 등을 포함한 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오.
3. 살아있는 바이러스가 적정될 때는 2등급 생물 안전 작업대를 사용하십시오.
   1. 샘플과 접촉하는 모든 물질(시약, 세척액 등)을 감염성 물질로 간주합니다.
   2. 오염된 물질을 표백제 용액(차아염소산나트륨 2,5%)에 30분 동안 담가 오염 물질을 처리합니다.
4. 우수한 실험실 관행에 따라 화학 물질을 취급하십시오.

2. 준비

1. 가능한 한 분석 등급 시약을 사용하십시오.
2. 코팅 완충액/탄산염 완충액, 부동태화 완충액, 희석액 및 구연산염 완충액(표 1)의 새 용액을 준비하고, 0.45 또는 0.22μm 필터를 통해 여과한 다음 분석 순도를 보존하기 위해 사용 하루 전에 4°C에서 보관합니다.
3. 시약을 사용하기 30분 전에 시약이 실온(+18 °C에서 +25 °C)에 도달하도록 하고 사용 전에 부드러운 혼합으로 균질화합니다.

3. 마이크로플레이트 민감성

참고: 다량의 면역글로불린을 결합하도록 최적화된 96웰 흡착 면역분석 플레이트를 사용합니다(예: 재료 표 참조).

1. 각 웰에 탄산염 완충액에 희석된 단클론 항체(mAb-D1) 200μL를 추가합니다.
   메모: 약 1 μg/mL의 최적 농도가 실험적으로 결정되었으며 이는 정제된 mAb-D1의 약 1/2000 희석에 해당합니다. 이 권장 농도는 각 mAb-D1 배치에 대해 표시되며 양성 대조군을 통해 주기적으로 확인해야 합니다.
2. 플레이트를 접착 필름으로 덮고 가습 분위기에서 37°C에서 3시간 동안 마이크로플레이트를 배양합니다.
3. 조심스럽게 흡인하고 2,5% 차아염소산나트륨 용액을 포함하는 수용체로 웰 함량을 옮깁니다.
4. 마이크로플레이트를 뒤집어 흡수성 종이에 올려 실온에서 5분 동안 건조시킵니다.

4. 마이크로플레이트 패시베이션

1. 각 웰에 300μL의 부동태화 완충액을 추가합니다.
2. 플레이트를 접착 필름으로 덮고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
3. 조심스럽게 흡인하고 웰 함량을 2,5% 차아염소산나트륨 용액을 함유하는 수취인으로 옮깁니다.
4. 마이크로플레이트를 뒤집어 흡수성 종이에 올려 실온에서 1분 동안 건조시킵니다.
   메모: 마이크로플레이트는 즉시 사용하거나 -20°C에서 밀봉하여 최대 3개월 동안 사용할 수 있습니다.

5. ELISA 분석

참고: 기준 백신의 통제 곡선을 설정하기 위해 5.3단계는 필요하지 않습니다. 테스트된 백신을 적정하려면 5.1단계부터 5.6단계까지 모두 필요합니다.

1. 감광된 마이크로플레이트의 세척
   1. 각 웰에 세척 버퍼를 300μL씩 추가합니다.
   2. 조심스럽게 흡인하고 웰 함량을 2,5% 차아염소산나트륨 용액을 함유하는 수취인으로 옮깁니다.
   3. 5.1.1 및 5.1.2 단계를 5회 더 반복하여 감광판을 광범위하게 세척합니다.
   4. 마이크로플레이트를 뒤집어 흡착제가 있는 종이에 올려 실온에서 1분간 건조시킵니다.
2. 대조군 곡선에 대한 reference vaccine의 희석
   1. 광견병 바이러스 당단백질 10μg/mL 농도에 해당하는 증류수 1mL에 기준 백신(검증 항원 Lot 09)을 재구성합니다.
   2. 1 μg/mL의 광견병 바이러스 당단백질에 도달하기 위해 희석제에 재구성 기준 백신을 10배 희석합니다.
   3. 표 1에 표시된 대로 희석제에 이 기준 백신을 6회 연속 2배 희석하여 준비합니다.
   희
   4. 석제 200μL를 중복(웰 1H/2H)으로 분배하여 빈 대조군 역할을 합니다.
   5. 각 참조 백신 희석액의 웰당 200μL를 중복(웰 G1/G2에서 A1/A2)으로 분배합니다.
3. 적정을 위해 테스트된 백신의 희석
   1. 희석제에 테스트된 백신을 10배 희석하여 준비합니다.
   2. 표 2에 나타난 바와 같이 희석액에 테스트된 백신의 7회 연속 희석액을 준비합니다.
   3. 테스트된 각 백신 희석액의 웰당 200μL를 중복(웰 H3/H4 - A3/A4)으로 분배합니다.
4. ELISA 플레이트의 배양/세척
   1. 마이크로플레이트를 접착 필름으로 덮고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
   2. 필름을 제거하고, 주의깊게 흡인하고 2,5% 차아염소산나트륨 해결책을 포함하는 수용자로 각 우물의 내용을 옮깁니다.
   3. 각 웰에 300μL의 세척 버퍼를 추가합니다.
   4. 조심스럽게 흡인하고 각 웰의 내용물을 2,5% 차아염소산나트륨 용액을 함유한 수용액으로 옮깁니다.
   5. 5.4.3 및 5.4.4 단계를 5회 반복하여 결합되지 않은 항원을 제거하고 코팅된 항체(mAb D1)에 결합된 G 단백질 삼량체를 보존합니다.
   6. 마이크로플레이트를 뒤집어 실온에서 흡수지에 올려 1분 동안 건조시킵니다.
5. 과산화효소 접합 mAb-D1의 결합
   1. peroxidase-labeled mAb-D1의 권장 희석량(1/2000)을 웰당 200μL를 희석액으로 분배합니다(약 1μg/mL 농도). 각 mAb-D1 배치에 대해 권장 농도가 표시되며 양성 대조군을 통해 주기적으로 확인해야 합니다.
   2. 마이크로플레이트를 접착 필름으로 덮고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
   3. 필름을 제거하고, 주의깊게 흡인하고 2,5% 차아염소산나트륨 해결책을 포함하는 수용자로 각 우물의 내용을 옮깁니다.
   4. 각 웰에 300μL의 세척 버퍼를 추가합니다.
   5. 조심스럽게 흡인하고 각 웰의 내용물을 2,5% 차아염소산나트륨 용액을 함유한 수용액으로 옮깁니다.
   6. 5.5.4 및 5.5.5 단계를 5회 반복하여 결합되지 않은 과산화효소 표지 항체(mAb D1)를 제거합니다.
   7. 마이크로플레이트를 뒤집어 실온에서 흡수지에 올려 1분 동안 건조시킵니다.
6. 기질-발색체를 사용한 계시
   1. 기질-발색 용액의 웰당 200μL를 분배합니다.
   2. 마이크로플레이트를 필름으로 밀봉하고 실온의 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다. 황색-주황색은 결합된 과산화효소 표지 항체(mAb D1)의 양에 비례하는 강도를 나타냅니다.
   3. 웰당 50 μL의 정지 용액을 첨가하여 반응을 중단합니다.
   4. 마이크로플레이트의 바닥을 조심스럽게 닦고 분광 광도계에 넣어 사용된 모든 웰(negative control(blank), reference vaccine 및 tested vaccine)의 492nm에서 광학 밀도(OD)를 측정합니다.
   5. 분석을 위해 .xls 또는 .xlsx 파일 형식으로 OD 데이터를 수집합니다.

표 1. 분석에 사용된 완충액.

완충액 및 시약	준비
코팅 버퍼 (탄산염 완충액 50mM pH=9.6)	원하는 pH (중탄산 나트륨의 약 1/10 부피)가 될 때까지 탄산나트륨 50 mM (NaHCO3 )에 탄산나트륨 50 mM (Na2CO 3-10H2O)을 추가합니다.
패시베이션 버퍼	0.3% 소 혈청 알부민(BSA, 분획 V), 탄산염 완충액 50mM pH 9.6의 5% 자당
10x 인산염 완충 식염수 pH=7 (PBS 10x)	증류수 1L에 NaCl 80g, KCl 2g, Na2PO 4-12H2O 11.33 g, KH2PO4 2g. 4N NaOH로 pH=7 조정
세척 버퍼	0.05% 트윈(1x PBS)
희석제	0.5% 소 혈청 알부민(분획 V), 1x PBS에서 0.05% 트윈(BSA에 의한 산성화로 인해 pH를 7로 조정)
구연산염 완충액 pH-5.6 (과산화효소 기질의 경우)	11.67g 구연산 삼나트륨-2H2O(Na3C6H5O 7-2H20), 증류수 1L에 2.17g 구연산-1H20
기질-발색원 용액	50 mg 오르토 페닐 렌 디아민 정제, 0.1 % 과산화수소 30 % (110 vol) 25 ml 구연산염 완충액 pH 5.6
중지 솔루션 (4N 황산)	80ml 냉각 증류수에 10ml H2SO4 36N. 희석은 얼음 수조에서 수행해야 합니다

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
클래스 II 생물학적 안전 캐비닛	써모피셔 사이언티픽	10445753	살아있는 바이러스를 적정하는 경우
투명 평면 이뮤노 비멸균 96웰 플레이트, 400 μL, MAXISORP	써모피셔 사이언티픽	439454	적재된 항체에 결합하는 데 좋습니다.
Labo 폴리프로필렌 실험실 흄 후드 장착	써모피셔 사이언티픽	12576606	황산의 제조를 위해
면역학 플레이트 Strong 흡착 MAXISORP 플랫 바텀 글쎄 F96	더처	55303	적재된 항체에 결합하는 데 좋습니다.
마이크로플레이트 씰링 테이프(100매)	써모피셔 사이언티픽	15036
마이크로플레이트 단일 모드 리더 Sunrise	테칸
마이크로플레이트 셰이커-인큐베이터	더처	441504
마이크로플레이트 와셔 Wellwash	써모피셔 사이언티픽	5165000
멀티채널 피펫(30-300 μL) 12채널	써모피셔 사이언티픽	제4661180엔
싱글채널 피펫 (키트 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL)	써모피셔 사이언티픽	4700880

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